Diário da República n.º 122

I SÉRIE DIÁRIO DA REPÚBLICA Quarta-feira, 27 de Junho de 2007 Número 122 ÍNDICE Ministério da Administração Interna Decreto-Lei n.o 247/2007: Define o regime jurídico aplicável à constituição, organização, funcionamento e extinção dos corpos de bombeiros, no território continental . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4064 Ministério da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas Decreto-Lei n.o 248/2007: Estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus (Spieckerman et Kottoff) Davis et al., causadora da podridão anelar da batateira, transpondo para a ordem jurídica interna a Directiva n.o 2006/56/CE, da Comissão, de 12 de Junho, que altera os anexos da Directiva n.o 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outubro, relativa à luta contra a podridão anelar da batateira . . . . . . . . . . . . 4069 o Decreto-Lei n. 249/2007: Estabelece as medidas de controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Ralstonia sola- nacearum (Smith) Yabuuchi et al., causadora da doença do pus ou mal murcho da batateira e do mal murcho tomateiro, transpondo para a ordem jurídica interna a Directiva n.o 2006/63/CE, da Comissão, de 14 de Julho, que altera os anexos II a VII da Directiva n.o 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. . . . . . . . . . . 4095 o Portaria n. 751/2007: Determina para a época venatória de 2007-2008 as espécies cinegéticas que é permitido caçar, bem como fixa os respectivos limites diários de abate, períodos de caça, processos e outros condicionamentos venatórios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4133 4064 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 MINISTÉRIO DA ADMINISTRAÇÃO INTERNA extinção dos corpos de bombeiros, no território con- tinental. Decreto-Lei n.o 247/2007 Artigo 2.o de 27 de Junho Definições Os grandes desastres que se têm verificado um pouco por todo o mundo têm vindo a promover uma ampla Para efeitos do presente decreto-lei entende-se por: discussão sobre a existência, em cada um dos países, de estruturas de resposta devidamente preparadas e a) «Área de actuação» a área geográfica predefinida, articuladas. na qual um corpo de bombeiros opera regularmente Em quase todas as situações, seja em grandes aci- e ou é responsável pela primeira intervenção; dentes provados pelo terrorismo internacional, decor- b) «Bombeiro» o indivíduo que, integrado de forma rentes da acção da natureza ou resultantes da actividade profissional ou voluntária num corpo de bombeiros, tem económica e dos movimentos populacionais, conclui-se por actividade cumprir as missões do corpo de bom- que os países se encontram insuficientemente dotados. beiros, nomeadamente a protecção de vidas humanas Uma das constatações mais relevantes e ao mesmo e bens em perigo, mediante a prevenção e extinção de tempo mais preocupante é a escassa articulação entre forças ou serviços de segurança e estruturas ou serviços incêndios, o socorro de feridos, doentes ou náufragos de protecção e socorro. e a prestação de outros serviços previstos nos regula- Em Portugal, o socorro às populações assenta nos mentos internos e demais legislação aplicável; corpos de bombeiros e assim continuará a ser mesmo c) «Corpo de bombeiros» a unidade operacional, ofi- que, entretanto, se tenham criado brigadas de sapadores cialmente homologada e tecnicamente organizada, pre- ou o grupo de intervenção de protecção e socorro que parada e equipada para o cabal exercício das missões colaboram no âmbito da primeira intervenção em incên- atribuídas pelo presente decreto-lei e demais legislação dios florestais, ou se venham a formar mais agentes aplicável; e constituam outras forças. d) «Entidade detentora de corpo de bombeiros» a Os corpos de bombeiros profissionais, mistos ou entidade pública ou privada que cria, detém e mantém voluntários, são, portanto, a base para uma resposta ao nível local e, articuladamente e sob um comando em actividade um corpo de bombeiros com observância único, ao nível distrital ou nacional. do disposto no presente decreto-lei e demais legislação Com o presente instrumento legislativo pretende con- aplicável; cretizar-se uma profunda mudança ao nível da estru- e) «Unidade de comando» o princípio de organização turação dos corpos de bombeiros e da sua articulação dos corpos de bombeiros que determina que todos os operacional. Promove-se uma redução do número de seus elementos actuam sob um comando hierarquizado quadros e definem-se as bases da actividade operacional. único. Os bombeiros voluntários passam a ser inseridos em duas carreiras, a carreira de oficial-bombeiro, que vem Artigo 3.o suprir uma grave lacuna no âmbito da incorporação de técnicos de nível superior, e a carreira de bombeiro. Missão dos corpos de bombeiros A mudança dos critérios de escolha dos comandos e a definição das densidades tendo em conta a realidade 1 — Constitui missão dos corpos de bombeiros: de cada corpo é uma das inovações mais significativas que se propõem. a) A prevenção e o combate a incêndios; Com este decreto-lei permite-se a criação das equipas b) O socorro às populações, em caso de incêndios, permanentes de intervenção, que o Programa do inundações, desabamentos e, de um modo geral, em Governo contempla, e abrem-se as portas para a criação todos os acidentes; de forças conjuntas e de forças especiais de intervenção. c) O socorro a náufragos e buscas subaquáticas; Finalmente, é muito significativa a consagração de d) O socorro e transporte de acidentados e doentes, um sistema de avaliação e de recenseamento que servirá incluindo a urgência pré-hospitalar, no âmbito do sis- à atribuição dos direitos e regalias previstos no regime tema integrado de emergência médica; jurídico dos bombeiros portugueses. Foram ouvidas a Associação Nacional de Municípios e) A emissão, nos termos da lei, de pareceres técnicos Portugueses e a Associação Nacional de Freguesias, e, em matéria de prevenção e segurança contra riscos de a título facultativo, a Liga dos Bombeiros Portugueses incêndio e outros sinistros; e a Associação Nacional dos Bombeiros Profissionais. f) A participação em outras actividades de protecção Foram, ainda, cumpridos os procedimentos de nego- civil, no âmbito do exercício das funções específicas que ciação e participação dos trabalhadores da Administra- lhes forem cometidas; ção Pública, nos termos da Lei n.o 23/98, de 16 de Maio. g) O exercício de actividades de formação e sensi- Assim: bilização, com especial incidência para a prevenção do Nos termos da alínea a) do n.o 1 do artigo 198.o da risco de incêndio e acidentes junto das populações; Constituição, o Governo decreta o seguinte: h) A participação em outras acções e o exercício de outras actividades, para as quais estejam tecnicamente CAPÍTULO I preparados e se enquadrem nos seus fins específicos e nos fins das respectivas entidades detentoras; Disposições gerais i) A prestação de outros serviços previstos nos regu- Artigo 1.o lamentos internos e demais legislação aplicável. Objecto 2 — O exercício da actividade definida nas alíneas a), O presente decreto-lei define o regime jurídico apli- b), c) e e) do número anterior é exclusivo dos corpos cável à constituição, organização, funcionamento e de bombeiros e demais agentes de protecção civil. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4065 CAPÍTULO II beiros misto, sem prejuízo de eventual primeira inter- venção de algum dos outros em benefício da rapidez Criação e extinção, área de actuação e tutela e prontidão do socorro. 3 — Fora dos casos previstos no número anterior, SECÇÃO I havendo no mesmo município vários corpos de bom- Criação e extinção, área de actuação e tutela beiros voluntários, a responsabilidade de actuação prio- ritária cabe ao corpo de bombeiros da respectiva área Artigo 4.o de actuação, ainda que exista intervenção conjunta de outros corpos de bombeiros, sem prejuízo de eventual Criação e extinção de corpos de bombeiros primeira intervenção de algum dos outros em benefício 1 — A criação de corpos de bombeiros pode ser pro- da rapidez e prontidão do socorro. movida pelas seguintes entidades: a) Municípios; Artigo 6.o b) Associações humanitárias de bombeiros; Tutela c) Outras pessoas colectivas privadas que pretendam criar corpos privativos de bombeiros. 1 — Ressalvando a autonomia das entidades deten- toras de corpos de bombeiros e sem prejuízo do disposto 2 — O processo de extinção de corpos de bombeiros no presente decreto-lei, a ANPC exerce a tutela sobre deve ser promovido pelas entidades suas detentoras ou os corpos de bombeiros nos seguintes termos: pela Autoridade Nacional de Protecção Civil (ANPC), ouvida a entidade detentora. a) Definição das áreas de actuação; 3 — A criação e extinção dos corpos de bombeiros b) Coordenação e inspecção técnica e operacional; devem resultar de uma ponderação técnica dos riscos, c) Homologação da adequação técnico-operacional dos tempos de actuação na área a proteger e das con- de veículos e definição das características técnicas de dições humanas, técnicas e operacionais disponíveis nos veículos e equipamentos; corpos de bombeiros existentes e sua articulação na cor- d) Definição dos programas de formação e de respondente área municipal. instrução. 4 — A criação e a extinção de corpos de bombeiros voluntários, mistos e profissionais dependem de homo- 2 — A tutela da ANPC sobre os corpos de bombeiros logação da ANPC. mistos ou voluntários criados e detidos pelas associações 5 — A criação e extinção de corpos de bombeiros humanitárias de bombeiros é exercida, ainda, nas seguin- voluntários ou mistos, da iniciativa de associações huma- tes áreas: nitárias de bombeiros, são precedidas de parecer das seguintes entidades: a) Aprovação dos regulamentos internos; b) Homologação dos quadros de pessoal. a) Câmara municipal da área de actuação do corpo de bombeiros; 3 — As câmaras municipais dão conhecimento à b) Juntas de freguesia da área a proteger; ANPC dos regulamentos internos e dos quadros de pes- c) Liga dos Bombeiros Portugueses. soal dos corpos de bombeiros profissionais e mistos. 6 — O parecer do órgão referido na alínea a) do número anterior relativo à criação dos corpos de bom- SECÇÃO II beiros, quando negativo, é vinculativo. 7 — As condições de criação de corpos privativos de Organização dos corpos de bombeiros bombeiros são definidas por diploma próprio. Artigo 7.o Artigo 5.o Espécies de corpos de bombeiros Áreas de actuação 1 — Nos municípios podem existir os seguintes corpos 1 — Cada corpo de bombeiros tem a sua área de de bombeiros: actuação definida pela ANPC, ouvido o Conselho Nacio- nal de Bombeiros, de acordo com os seguintes princípios: a) Corpos de bombeiros profissionais; b) Corpos de bombeiros mistos; a) A área de actuação de cada corpo de bombeiros c) Corpos de bombeiros voluntários; é correspondente à do município onde se insere, se for d) Corpos privativos de bombeiros. o único existente; b) Se existirem vários corpos de bombeiros voluntários 2 — Os corpos de bombeiros profissionais têm as no mesmo município, as diferentes áreas de actuação características seguintes: correspondem a uma parcela geográfica que coincide, obrigatoriamente, com uma ou mais freguesias con- a) São criados, detidos e mantidos na dependência tíguas. directa de uma câmara municipal; b) São exclusivamente integrados por elementos 2 — Havendo no mesmo município um corpo de bom- profissionais; beiros profissional ou misto e um ou mais corpos de c) Detêm uma estrutura que pode compreender a bombeiros voluntários, a responsabilidade de actuação existência de regimentos, batalhões, companhias ou sec- prioritária e comando cabe ao corpo de bombeiros pro- ções, ou pelo menos, de uma destas unidades estruturais; fissional ou, quando este não exista, ao corpo de bom- d) Designam-se bombeiros sapadores. 4066 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 3 — Os corpos de bombeiros mistos têm as carac- 2 — Os elementos que compõem os corpos de bom- terísticas seguintes: beiros voluntários ou mistos, integram os seguintes qua- dros de pessoal: a) São dependentes de uma câmara municipal ou de uma associação humanitária de bombeiros; a) Quadro de comando; b) São constituídos por bombeiros profissionais e por b) Quadro activo; bombeiros voluntários, sujeitos aos respectivos regimes c) Quadro de reserva; jurídicos; d) Quadro de honra. c) Estão organizados, de acordo com o modelo pró- prio, definido pela respectiva câmara municipal ou pela 3 — O quadro de comando é constituído pelos ele- associação humanitária de bombeiros, nos termos de mentos do corpo de bombeiros a quem é conferida a regulamento aprovado pela ANPC, ouvido o Conselho autoridade para organizar, comandar e coordenar as Nacional de Bombeiros. actividades exercidas pelo respectivo corpo, incluindo, a nível operacional, a definição estratégica dos objectivos 4 — Os corpos de bombeiros voluntários têm as carac- e das missões a desempenhar. terísticas seguintes: 4 — O quadro activo é constituído pelos elementos aptos para a execução das missões a que se refere o a) Pertencem a uma associação humanitária de artigo 3.o, normalmente integrados em equipas, em cum- bombeiros; primento das ordens que lhes são determinadas pela b) São constituídos por bombeiros em regime de hierarquia, bem como das normas e procedimentos voluntariado; estabelecidos. c) Podem dispor de uma unidade profissional mínima 5 — O quadro de reserva é constituído pelos elemen- a definir por regulamento da ANPC, ouvido o Conselho tos que atinjam o limite de idade para permanecer na Nacional de Bombeiros. sua categoria ou que, não podendo permanecer nos res- tantes quadros por motivos profissionais ou pessoais, 5 — Os corpos privativos de bombeiros têm as carac- o requeiram e obtenham aprovação do comandante do terísticas seguintes: corpo de bombeiros. a) Pertencem a uma pessoa colectiva privada que tem 6 — O quadro de honra é constituído pelos elementos necessidade, por razões da sua actividade ou do seu que, com zelo, dedicação, disponibilidade e abnegação património, de criar e manter um corpo profissional desempenharam, durante um longo período de tempo, de bombeiros para autoprotecção; sem qualquer punição disciplinar, funções num corpo b) São integrados por bombeiros com a formação de bombeiros ou que adquiriram incapacidade por adequada; doença ou acidente ocorrido em serviço. c) Organizam-se segundo um modelo adequado às suas missões e objectivos, nos termos de regulamento aprovado pela ANPC; Artigo 10.o d) Têm uma área de actuação definida dentro dos Dotação de pessoal nos quadros limites da propriedade da entidade ou entidades à qual pertencem, podendo actuar fora dessa área por requi- 1 — A dotação em recursos humanos dos quadros sição do presidente de câmara no respectivo município, de comando e activo dos corpos de bombeiros profis- ou da ANPC, quando fora do município, que suporta sionais e mistos detidos e mantidos na dependência de os encargos inerentes; um município é fixada em decreto-lei. e) A sua criação e manutenção constituem encargo 2 — A estrutura do quadro de comando tem a dotação das entidades a que pertencem, não sendo abrangidas máxima de cinco elementos. por apoios da ANPC. 3 — A dotação em recursos humanos dos corpos de bombeiros mistos e voluntários detidos e mantidos na dependência de uma associação humanitária de bom- Artigo 8.o beiros tem a seguinte tipologia: Veículos e equipamentos a) Tipo 4 — até 60 elementos; Os tipos, características, classificações, normalização b) Tipo 3 — até 90 elementos; técnica e dotações mínimas de veículos e demais equi- c) Tipo 2 — até 120 elementos; pamentos operacionais que podem ser detidos pelos cor- d) Tipo 1 — superior a 120 elementos. pos de bombeiros, dos diversos tipos e espécies, são definidos por regulamento da ANPC, depois de ouvido 4 — A dotação de oficiais bombeiros no quadro activo o Conselho Nacional de Bombeiros, e homologados por não pode ser superior a 25 % da dotação efectiva dos despacho do Ministro da Administração Interna. elementos de carreira de bombeiro. 5 — O número de elementos dos corpos de bombeiros não pertencentes aos quadros de comando e activo não SECÇÃO III releva para efeitos de tipificação. Quadros dos corpos de bombeiros Artigo 11.o Artigo 9.o Situação no quadro Quadros de pessoal 1 — Os elementos voluntários dos diversos quadros 1 — Os quadros dos corpos de bombeiros profissio- dos corpos de bombeiros voluntários e mistos podem nais e dos corpos privativos de bombeiros estruturam-se encontrar-se nas situações de actividade ou inactividade de acordo com o regime a definir em decreto-lei. no quadro. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4067 2 — Encontram-se na situação de actividade no qua- 3 — À carreira de bombeiro correspondem funções dro os elementos que estão no desempenho activo das de execução e chefia intermédia. missões confiadas ao corpo de bombeiros, de acordo com as escalas de serviço e ainda: Artigo 14.o a) Os que estão no gozo autorizado de férias ou de Quadro de reserva nos corpos de bombeiros licença por doença, maternidade ou paternidade; voluntários ou mistos b) Os bombeiros do sexo feminino que se encontram indisponíveis para o desempenho assíduo e activo de 1 — Integram o quadro de reserva: funções por motivos de gravidez, parto e pós-parto, num período máximo de um ano; a) Os elementos dos corpos de bombeiros que atinjam c) Os que estão ausentes por tempo não superior o limite de idade para permanência na respectiva car- a um ano em missão considerada, nos termos da lei, reira e não reúnam os requisitos para ingressar no qua- de relevante serviço público. dro de honra; b) Os que estejam impedidos de prestar serviço regu- 3 — Consideram-se na situação de inactividade: lar por período superior a um ano; c) Os que, por razões de saúde, revelem incapacidade a) Os que se encontram fora do exercício de funções ou dificuldade no exercício das suas funções; por tempo não superior a um ano e por motivo diverso d) Os elementos do quadro activo que não tenham dos referidos no número anterior; cumprido, durante o ano anterior, o serviço operacional b) Aqueles a quem foi aplicada a pena de suspensão. previsto no artigo 17.o do presente decreto-lei. 4 — O tempo decorrido na situação de inactividade 2 — Os elementos do quadro de reserva podem soli- não é considerado para efeitos de contagem de tempo de serviço e suspende os direitos previstos no regime citar o seu regresso ao quadro activo, desde que exista jurídico dos bombeiros portugueses. vaga no respectivo quadro e para tal reúnam condições. 5 — O comandante do corpo de bombeiros remete 3 — Os elementos do quadro de reserva devem ser anualmente à ANPC e à respectiva câmara municipal, dotados de fardamento e equipamento operacional ade- em modelo próprio e por via informática, a relação do quado e incluídos em apólice especial de seguros de pessoal que se encontra na situação de actividade no acidentes pessoais. quadro. 4 — Aos elementos do quadro de reserva podem ser atribuídas, pelo comandante, as seguintes funções: Artigo 12.o a) Integrar a representação do corpo de bombeiros Quadro de comando nos corpos de bombeiros em cerimónias, festividades e outros actos similares; voluntários ou mistos b) Colaborar, partilhando a experiência e os conhe- 1 — A estrutura do quadro de comando nos corpos cimentos adquiridos, em acções de formação, no seio mistos e voluntários é composta por: do corpo de bombeiros; c) Colaborar nas diversas actividades desenvolvidas a) Comandante; pelo corpo de bombeiros, compatíveis com as respectivas b) 2.o comandante; capacidades físicas e intelectuais. c) Adjuntos de comando. 2 — O comandante dirige o corpo de bombeiros e Artigo 15.o é o primeiro responsável pelo desempenho do corpo Quadro de honra nos corpos de bombeiros e dos seus elementos, no cumprimento das missões que voluntários ou mistos lhes são cometidas. 3 — O comandante é coadjuvado nas suas funções 1 — Podem ingressar no quadro de honra os elemen- pelo 2.o comandante, que o substitui na sua ausência tos que: e nos seus impedimentos, e pelos adjuntos de comando. 4 — A estrutura de comando dos corpos de bombeiros a) Tenham prestado serviço efectivo durante mais é composta: de 15 anos no quadro de comando; b) Tenham prestado, com zelo, dedicação, disponi- a) Nos corpos de bombeiros voluntários ou mistos bilidade e abnegação, durante mais de 15 anos, sem de tipo 4, por um comandante e um 2.o comandante; qualquer punição disciplinar, funções no quadro activo; b) Nos corpos de bombeiros mistos ou voluntários c) Tenham adquirido incapacidade física em resultado de tipo 3, por um comandante, um 2.o comandante e de doença ou acidente, ocorridos em serviço; um adjunto; d) Tenham prestado serviços à causa dos bombeiros, c) Nos corpos de bombeiros voluntários ou mistos classificados, justificadamente, como de carácter excep- de tipo 2, por um comandante, um 2.o comandante e cional. dois adjuntos; d) Nos corpos de bombeiros voluntários ou mistos de tipo 1, por um comandante, um 2.o comandante e 2 — O ingresso no quadro de honra é feito a reque- três adjuntos. rimento do interessado, dirigido à ANPC, e depende de parecer favorável da entidade detentora do corpo Artigo 13.o de bombeiros, caso se trate do comandante, ou do comandante e da entidade detentora do corpo de bom- Quadro activo nos corpos de bombeiros voluntários ou mistos beiros, tratando-se dos restantes elementos. 1 — O quadro activo compreende as seguintes car- 3 — O ingresso no quadro de honra permite a pro- reiras verticais: moção, a título honorífico, à categoria seguinte da que era exercida no respectivo quadro activo. a) Carreira de oficial bombeiro; 4 — Aos elementos do quadro de honra podem ser b) Carreira de bombeiro. atribuídas, pelo comandante, as seguintes funções: 2 — À carreira de oficial bombeiro correspondem a) Integrar a representação do corpo de bombeiros funções técnicas superiores de chefia. em cerimónias, festividades e outros actos similares; 4068 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 b) Colaborar, partilhando a experiência e os conhe- Artigo 19.o cimentos adquiridos, em acções de formação, no seio Forças especiais do corpo de bombeiros; c) Colaborar nas diversas actividades desenvolvidas 1 — No âmbito do cumprimento das missões previstas pelo corpo de bombeiros, compatíveis com as respectivas no artigo 3.o, a ANPC pode organizar forças especiais capacidades físicas e intelectuais. com base no recrutamento de oficiais bombeiros e bom- beiros do quadro activo dos corpos mistos ou volun- 5 — Para os fins do número anterior, os elementos tários. do quadro de honra devem ser dotados de fardamento 2 — As forças especiais podem cumprir missões de adequado e, bem assim, incluídos em apólice especial cooperação internacional ou de auxílio a operações nas de seguros de acidentes pessoais. Regiões Autónomas. 3 — As forças especiais devem ter uma estrutura e SECÇÃO IV comando próprio. 4 — A estrutura de comando é constituída por recru- Actividade operacional tamento no âmbito dos quadros de comando dos corpos de bombeiros mistos ou voluntários. Artigo 16.o Unidade de comando Os corpos de bombeiros organizam-se de acordo com CAPÍTULO III o princípio da unidade de comando. Instrução e formação Artigo 17.o Artigo 20.o Serviço operacional Instrução 1 — A actividade operacional desenvolvida pelo pes- soal dos corpos de bombeiros tem natureza interna ou 1 — A instrução do pessoal dos corpos de bombeiros externa. é ministrada sob direcção do comandante e de acordo 2 — A actividade interna é prestada no perímetro com programa previamente estabelecido e aprovado interior das instalações do corpo de bombeiros, de pela ANPC, ouvido o Conselho Nacional de Bombeiros, acordo com os regulamentos. dividindo-se nas seguintes modalidades: 3 — A actividade externa é prestada fora das insta- lações, no cumprimento das missões previstas no a) Instrução inicial, destinada a habilitar os cadetes artigo 3.o do presente decreto-lei. e estagiários para o ingresso na carreira de bombeiro; 4 — Na sua área de actuação, cada corpo de bom- b) Instrução inicial, destinada a habilitar os estagiários beiros assegura a actividade operacional em todos os para o ingresso na carreira de oficial bombeiro; serviços para os quais for solicitado e seja considerado c) Instrução de acesso, destinada a todos os elementos apto ou, fora dela, em todos aqueles que, nos termos das carreiras de oficial bombeiro e bombeiro, necessária legais, lhe forem requisitados. à progressão na respectiva carreira; 5 — Nos municípios em que se justifique, os corpos d) Instrução contínua, que visa o treino e o saber de bombeiros voluntários ou mistos detidos pelas asso- fazer, através do aperfeiçoamento permanente do pes- ciações humanitárias de bombeiros podem dispor de soal do corpo de bombeiros. equipas de intervenção permanente, cuja composição e funcionamento é definida por portaria do membro 2 — O comandante elabora, até ao final de cada ano, do Governo responsável pela área da administração um plano de instrução que estabelece as actividades interna. mínimas a desenvolver no ano seguinte, pelo seu corpo 6 — O serviço operacional dos bombeiros voluntários, de bombeiros, do qual dá conhecimento à entidade designadamente no que concerne ao número de horas detentora e submete a aprovação da ANPC. de actividade, tipologia de serviço a prestar e obrigações no âmbito da formação que devem ser cumpridas para obtenção dos direitos, benefícios e regalias previstos no Artigo 21.o regime jurídico dos bombeiros portugueses, é aprovado Formação por portaria do membro do Governo responsável pela área da administração interna, ouvido o Conselho Nacio- 1 — O pessoal do quadro activo, que se encontre na nal de Bombeiros. situação de actividade no quadro, tem direito à formação Artigo 18.o adequada no respectivo corpo de bombeiros e à fre- Forças conjuntas quência de cursos, colóquios, seminários e outras acções de formação destinadas ao seu aperfeiçoamento técnico. 1 — Nos municípios onde existam mais de um corpo 2 — Quando se trate de acções formativas cuja rea- de bombeiros podem ser criadas forças conjuntas que lização ou simples frequência esteja prevista no plano desenvolvam a sua actividade de forma partilhada. de actividades da ANPC, a participação dos bombeiros 2 — Uma força conjunta pode ser constituída pela pode envolver, em condições a definir pela mesma enti- integração da totalidade, ou parte, dos quadros activos dade, o pagamento de comparticipações por salários per- de cada corpo de bombeiros. didos, despesas de transportes, alojamento e alimen- 3 — O comando da força conjunta é determinado por tação, ocasionados por ausências ao serviço, autorizadas decisão dos comandantes dos corpos de bombeiros pelas respectivas entidades empregadoras e por deslo- envolvidos. cações para fora da área do corpo de bombeiros. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4069 Artigo 22.o Artigo 29.o Formação específica Escolas de infantes e cadetes Compete à ANPC assegurar acções de formação 1 — Os corpos de bombeiros podem criar e deter necessárias ao ingresso nas estruturas de comando, ao escolas de infantes e cadetes. ingresso e progressão nas carreiras de oficial bombeiro 2 — As escolas de infantes e cadetes destinam-se à e de bombeiro. formação no âmbito do voluntariado e da protecção CAPÍTULO IV e socorro. 3 — O universo de recrutamento das escolas de infan- Registo e recenseamento tes é feito de entre indivíduos com idades entre os 6 e os 16 anos. Artigo 23.o 4 — O universo de recrutamento das escolas de cade- Processos individuais tes é feito de entre indivíduos com idades entre os 16 e os 18 anos. 1 — Os corpos de bombeiros dispõem de um processo 5 — A matéria objecto da formação a que se refere individual de cada bombeiro, independentemente do o n.o 2 do presente artigo articula-se com a área de quadro a que pertença, do qual constam os factos rela- formação cívica ministrada no ensino básico, nos termos cionados com o tempo e a qualidade do serviço prestado, a regulamentar por despacho conjunto dos membros incluindo o seu registo disciplinar. do Governo responsáveis pelas áreas da administração 2 — O modelo de processo individual é aprovado pela ANPC, ouvido o Conselho Nacional de Bombeiros. interna e da educação. 6 — É vedado aos infantes e cadetes o exercício de actividade operacional. Artigo 24.o 7 — Os infantes e cadetes integram a apólice de segu- Recenseamento nacional ros do quadro de reserva do respectivo corpo de bombeiros. 1 — Compete à ANPC criar e manter o Recensea- mento Nacional dos Bombeiros Portugueses. Artigo 30.o 2 — Os corpos de bombeiros devem manter perma- Norma revogatória nentemente actualizada, por via informática, a infor- mação sobre os seus quadros activo, de reserva e de São revogados: honra, no Recenseamento Nacional dos Bombeiros Portugueses. a) O Decreto-Lei n.o 295/2000, de 17 de Novembro; b) O Decreto Regulamentar n.o 41/97, de 7 de CAPÍTULO V Outubro. Disposições transitórias e finais Artigo 31.o Entrada em vigor Artigo 25.o O presente decreto-lei entra em vigor no 1.o dia do Regulamentos internos 3.o mês após a sua publicação, sem prejuízo do disposto Com base em modelo a elaborar pela ANPC, os cor- no artigo 28.o pos de bombeiros devem adaptar os seus regulamentos internos ao presente decreto-lei, no prazo máximo de Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 15 de 90 dias contados a partir da sua entrada em vigor. Março de 2007. — José Sócrates Carvalho Pinto de Sousa — José Manuel Santos de Magalhães — Emanuel Augusto dos Santos — José António Fonseca Vieira da Artigo 26.o Silva — Maria de Lurdes Reis Rodrigues. Regulamento de ordem unida, honra e continências Promulgado em 7 de Junho de 2007. A matéria respeitante à ordem unida, honra e con- tinências consta de regulamento aprovado por portaria Publique-se. do membro do Governo responsável pela administração interna, ouvido o Conselho Nacional de Bombeiros. O Presidente da República, ANÍBAL CAVACO SILVA. Referendado em 8 de Junho de 2007. Artigo 27.o O Primeiro-Ministro, José Sócrates Carvalho Pinto de Transição de quadros Sousa. Os bombeiros voluntários do actual quadro de espe- cialistas e auxiliares são integrados nas carreiras de bom- beiros previstas no presente decreto-lei, nos termos a fixar por despacho do membro do Governo responsável pela área da administração interna, ouvido o Conselho MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, Nacional de Bombeiros. DO DESENVOLVIMENTO RURAL E DAS PESCAS Artigo 28.o Decreto-Lei n.o 248/2007 Regulamentação de 27 de Junho A regulamentação prevista no presente decreto-lei A doença provocada pelo agente patogénico Clavi- deve ser aprovada dentro de 180 dias após a publicação bacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepedonicus do decreto-lei. (Spieckerman et Kottoff) Davis et al., vulgarmente desig- 4070 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 nada por podridão anelar da batata, é um factor de Assim: redução da produção da cultura da batateira e repre- Nos termos da alínea a) do n.o 1 do artigo 198.o da senta um risco para esta cultura não só no País como Constituição, o Governo decreta o seguinte: também em todo o território comunitário se não forem tomadas medidas de protecção fitossanitária eficazes. Tornou-se, pois, necessário estabelecer medidas de CAPÍTULO I controlo fitossanitário destinadas a evitar a introdução Disposições gerais e a dispersão daquele organismo patogénico no terri- tório nacional, competindo, para o efeito, à Direcção- Artigo 1.o -Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a defi- Transposição de directivas nição, a elaboração, a coordenação e a aplicação do programa nacional de prospecção do organismo pre- O presente decreto-lei transpõe para a ordem jurídica judicial. interna a Directiva n.o 2006/56/CE, da Comissão, de Neste contexto, foi publicada a Portaria n.o 140/95, 12 de Junho, que altera os anexos da Directiva de 9 de Fevereiro, que aprovou as medidas fitossanitárias n.o 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outubro, relativa destinadas a evitar a introdução e a propagação daquele à luta contra a podridão anelar da batateira, procedendo, agente patogénico no território nacional e definiu os simultaneamente, à consolidação legislativa da transpo- procedimentos a adoptar para a implementação do refe- sição de ambas as directivas. rido programa, através nomeadamente de disposições técnicas quanto à forma de conservação das amostras Artigo 2.o testadas e rastreabilidade do organismo prejudicial, Objecto transpondo a Directiva n.o 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outubro, relativa à luta contra a podridão anelar 1 — O presente decreto-lei estabelece as medidas de da batateira. controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria Foi, entretanto, publicada a Directiva n.o 2006/56/CE, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. sepe- da Comissão, de 12 de Junho, que veio alterar os anexos donicus (Spieckerman et Kottoff) Davis et al., causadora da Directiva n.o 93/85/CE, do Conselho, de 4 de Outu- da podridão anelar da batateira, a seguir designada por bro. Estes anexos foram substancialmente alterados, organismo prejudicial, no sentido de evitar o seu apa- quer para fazer face aos avanços significativos em termos recimento e, uma vez detectada, localizá-la e determinar da compreensão da biologia, dos procedimentos de a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la detecção e de identificação do agente patogénico quer com vista à sua eventual erradicação. para enquadrar a experiência obtida na luta contra 2 — O disposto no presente decreto-lei é aplicável, aquele organismo prejudicial através da revisão de várias sem prejuízo do disposto no Decreto-Lei n.o 154/2005, de 6 de Setembro, na redacção que lhe foi dada pelo disposições técnicas relacionadas com as medidas de Decreto-Lei n.o 193/2006, de 26 de Setembro, que actua- controlo. liza o regime fitossanitário que cria e define as medidas No tocante aos procedimentos de detecção e de iden- de protecção fitossanitária destinadas a evitar a intro- tificação, foram introduzidos procedimentos recente- dução e dispersão no território nacional e comunitário, mente desenvolvidos como a hibridação fluorescente in incluindo nas zonas protegidas, de organismos preju- situ (FISH) e a reacção em cadeia da polimerase (PCR), diciais aos vegetais e produtos vegetais, qualquer que bem como melhorias nos diversos métodos laboratoriais seja a sua origem ou proveniência. a utilizar. Quanto aos elementos técnicos das medidas de con- trolo, introduzem-se disposições que permitem melhorar CAPÍTULO II a forma de conservação das amostras testadas, no sentido Controlo do organismo prejudicial de assegurar a rastreabilidade do organismo prejudicial, a reunião dos elementos necessários para determinar a Artigo 3.o dimensão provável da contaminação, os pormenores da comunicação de qualquer presença confirmada do orga- Prospecção oficial nismo prejudicial e da zona contaminada relevante e a 1 — Para efeitos do disposto no n.o 1 do artigo ante- aplicação das medidas em locais de produção designados rior, a Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvi- como contaminados e no interior das zonas demarcadas. mento Rural (DGADR) define, elabora e coordena a Deste modo, face à obrigatoriedade de proceder à aplicação do programa nacional de prospecção do orga- transposição da Directiva n.o 2006/56/CE, da Comissão, nismo prejudicial, cuja execução se realiza anualmente. de 12 de Junho, aliada ao facto de ser necessário actua- 2 — A execução do programa de prospecção referido lizar, por um lado, não só todo o regime específico de no número anterior cabe aos serviços de inspecção fitos- medidas fitossanitárias aplicáveis mas também as refe- sanitária das direcções regionais de agricultura e pescas rências aos serviços oficiais com competências na maté- (DRAP) e dos correspondentes organismos das Regiões ria e, por outro, enquadrar tais disposições com o actual Autónomas dos Açores e da Madeira, nas respectivas regime fitossanitário aprovado pelo Decreto-Lei áreas de actuação. n.o 154/2005, de 6 de Setembro, importa que se opte 3 — As prospecções previstas no programa nacional por publicar um decreto-lei que comporte a consoli- incidem obrigatoriamente sobre tubérculos e, sempre dação legislativa de toda a matéria em apreço. que apropriado, em plantas de batateira de Solanum Foram ouvidos os órgãos de governo próprio das tuberosum L., sendo que: Regiões Autónomas. a) Quando se tratar de tubérculos, são colhidas amos- Foi promovida a audição do Conselho Nacional do tras tanto de batata-semente como de outras batatas, Consumo. de preferência provenientes de lotes em armazém, que Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4071 são submetidas a testes laboratoriais oficiais ou reali- no n.o 4 do artigo 3.o, os serviços de inspecção fitos- zados sob controlo oficial, utilizando o método para sanitária da DRAP competente devem: a detecção e diagnóstico do organismo prejudicial refe- rido no número seguinte, podendo, se adequado, ser a) Zelar pelo cumprimento dos procedimentos esta- efectuada uma inspecção visual oficial ou oficialmente belecidos no n.o 2 do anexo II; controlada, através de corte de tubérculos noutras b) Declarar contaminados os tubérculos e ou plantas amostras; de batateira, as remessas e ou lotes, a maquinaria, os b) Quando se tratar de plantas, estas prospecções veículos, os navios, os armazéns ou respectivas partes são efectuadas segundo métodos adequados e as amos- e quaisquer outros objectos, incluindo material de emba- tras são submetidas a testes laboratoriais de acordo com lagem, em que tiver sido colhida a amostra, e, quando o disposto no número seguinte. adequado, o local ou locais de produção e os campos onde tiverem sido colhidos os tubérculos ou as plantas 4 — O método de diagnóstico, detecção e identifi- de batateira; cação do organismo prejudicial nos tubérculos é o refe- c) Determinar, na sequência da declaração de con- rido no anexo I do presente decreto-lei, do qual faz taminação dos tubérculos ou plantas de batateira, a rea- parte integrante, devendo ser utilizado para as plantas lização de testes laboratoriais de acordo com o disposto de batateira qualquer outro método adequado oficial ou oficialmente controlado. no n.o 4 do artigo 3.o nos lotes de batata com uma 5 — A DGADR deve comunicar anualmente à relação clonal com a batata infectada, sendo que os Comissão Europeia e aos demais Estados membros os testes são realizados no número de tubérculos ou plantas resultados da execução do programa nacional de pros- necessário para determinar a provável fonte primária pecção do organismo prejudicial. de infecção e a extensão da contaminação provável, de preferência por ordem do grau de risco; Artigo 4.o d) Determinar, tendo em conta o disposto no n.o 1 do anexo III do presente decreto-lei, do qual faz parte Dever de informação em relação ao organismo prejudicial integrante, a extensão da contaminação provável por Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença contacto pré ou pós-colheita ou por relação de produção do organismo prejudicial em plantas de batateira e ou com a contaminação declarada; em tubérculos colhidos, armazenados ou comercializa- e) Demarcar uma zona, com base na declaração de dos no território nacional deve informar de imediato contaminação, na determinação da extensão da conta- os serviços de inspecção fitossanitária das DRAP ou minação provável e na possível dispersão do organismo a DGADR. prejudicial, tendo em conta o disposto no n.o 2 do Artigo 5.o anexo III. Procedimentos no caso de suspeita da presença do organismo prejudicial 2 — A DGADR deve comunicar à Comissão Euro- peia e aos outros Estados membros qualquer contami- 1 — Considera-se estar perante uma ocorrência sus- nação declarada e os pormenores respeitantes à demar- peita quando a confirmação da presença do organismo cação da zona. prejudicial se tenha verificado por meio de: 3 — A comunicação referida no número anterior deve a) Observação de sintomas visuais de diagnóstico sus- ser efectuada nos termos do disposto no n.o 3 do peito da doença; ou anexo III. b) Obtenção de um resultado positivo num teste de Artigo 7.o imunofluorescência, através de uma leitura positiva num teste de rastreio confirmada por um resultado positivo Medidas de protecção fitossanitária subsequentes num segundo teste de rastreio apropriado (PCR/FISH), tal como consta do anexo I. 1 — Os tubérculos e ou as plantas de batateira decla- rados contaminados não podem ser plantados e, sob 2 — Em caso de ocorrência suspeita, os serviços de controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da inspecção fitossanitária da DRAP competente devem: DRAP competente são: a) Assegurar a realização de testes laboratoriais ofi- a) Destruídos; ciais ou oficialmente controlados, conforme previsto no b) Eliminados de outro modo, de acordo com medidas n.o 4 do artigo 3.o, de acordo com as condições definidas oficialmente controladas, nos termos do n.o 1 do no n.o 1 do anexo II do presente decreto-lei, do qual anexo IV e do anexo V do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a fim de confirmar ou refutar a fazem parte integrante, desde que se tenha concluído ocorrência suspeita; não existir qualquer risco identificável de dispersão do b) Proibir a utilização e a circulação de todos os lotes organismo prejudicial. ou remessas dos quais tenham sido colhidas amostras, excepto sob o seu controlo e desde que se tenha con- 2 — Os tubérculos e ou as plantas de batateira con- cluído que não existe qualquer risco identificável de dis- siderados provavelmente contaminados não podem ser persão do organismo prejudicial; c) Adoptar medidas adicionais a fim de determinar plantados e, sem prejuízo do resultados dos testes refe- a origem da ocorrência suspeita e evitar a dispersão ridos na alínea c) do n.o 1 do artigo anterior, para os do organismo prejudicial. lotes de batata com relação clonal, são, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP com- petente, alvo de utilização ou eliminação adequados, Artigo 6.o nos termos especificados no n.o 2 do anexo IV, e em Procedimentos no caso de confirmação da presença condições que garantam a inexistência de qualquer risco do organismo prejudicial identificável de dispersão do organismo prejudicial. 1 — Sempre que a presença do organismo prejudicial 3 — Toda a maquinaria, os veículos, os navios, os seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros objec- 4072 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 tos, incluindo o material de embalagem, declarados con- CAPÍTULO III taminados ou considerados provavelmente contamina- dos são destruídos ou limpos e desinfectados segundo Regime contra-ordenacional métodos adequados, como especificado no n.o 3 do anexo IV, sendo que após a desinfecção esses objectos Artigo 12.o deixam de ser considerados contaminados. Contra-ordenações 4 — Sem prejuízo das medidas aplicadas nos termos dos números anteriores, na zona demarcada são, tam- 1 — As seguintes infracções constituem contra-orde- bém, aplicadas as medidas especificadas no n.o 4 do nações puníveis com coima cujo montante mínimo é anexo IV. de E 100 e máximo de E 3740 ou mínimo de E 250 5 — Só é permitida a plantação de batata-semente e máximo de E 44 890, consoante o agente seja pessoa desde que: singular ou colectiva: a) Sejam satisfeitas as exigências estabelecidas no a) A omissão do dever de informação previsto no Decreto-Lei n.o 154/2005, de 6 de Setembro; artigo 4.o; b) A batata seja proveniente, em linha directa, de b) O não cumprimento das medidas de protecção material obtido no âmbito de um programa oficialmente fitossanitária determinadas e mandadas aplicar ao aprovado que tenha sido declarado isento do organismo abrigo do artigo 8.o e em violação do disposto nos arti- prejudicial em testes oficiais ou controlados oficial- gos 5.o e 7.o; mente, utilizando o método previsto no n.o 4 do artigo 3.o c) O não cumprimento dos encargos financeiros resul- tantes da aplicação das medidas de protecção fitossa- 6 — Os testes referidos na alínea b) do número ante- nitária a aplicar ao abrigo do artigo 8.o, em violação rior devem ser realizados: do disposto no artigo 9.o; d) A posse e o manuseamento do organismo pre- a) Quando a contaminação afectar a produção de judicial, em violação do disposto no artigo 10.o batata-semente nas plantas da selecção clonal inicial; b) Nos restantes casos, tanto nas plantas da selecção 2 — A tentativa e a negligência são puníveis, sendo clonal inicial como em amostras representativas de bata- nesse caso reduzidos para metade os limites mínimos ta-semente de base ou de material de multiplicação e máximos referidos no número anterior. anterior. Artigo 8.o Artigo 13.o Notificação das medidas fitossanitárias Sanções acessórias As medidas de protecção fitossanitária determinadas 1 — Em função da gravidade da infracção e da culpa e mandadas aplicar são objecto de notificações oficiais do agente, podem ser aplicadas, simultaneamente com emanadas das DRAP, dirigidas às pessoas singulares as coimas, as seguintes sanções acessórias: e colectivas envolvidas. a) Perda de objectos pertencentes ao agente; b) Interdição do exercício de profissões ou actividades cujo exercício dependa de título público ou de auto- Artigo 9.o rização ou de homologação de autoridade pública; Encargos dos operadores económicos c) Privação do direito a subsídio ou benefício outor- gado por entidades ou serviços públicos; Os encargos resultantes da aplicação das medidas de d) Privação do direito de participar em feiras ou protecção fitossanitária referidas no número anterior mercados; são suportados pelos respectivos operadores econó- e) Encerramento de estabelecimento cujo funciona- micos. mento esteja sujeito a autorização de autoridade admi- nistrativa; Artigo 10.o f) Suspensão de autorizações. Proibição 2 — As sanções previstas no número anterior têm a É proibida a posse e manuseamento do organismo duração máxima de um ano. prejudicial. 3 — No caso de uma conduta contra-ordenacional ter ocasionado um grave risco de propagação do organismo Artigo 11.o prejudicial, deve ser dada publicidade à decisão con- Derrogações denatória definitiva de aplicação da coima, mediante a afixação de editais na sede da DRA da área onde Para fins experimentais ou científicos e trabalhos de foi praticada a infracção. selecção varietal, a DGADR pode autorizar a não exe- cução do disposto na alínea c) do n.o 1 do artigo 6.o, nos n.os 1 a 4 do artigo 7.o e no artigo 10.o, para efeitos Artigo 14.o de aplicação do Decreto-Lei n.o 91/98, de 14 de Abril, Processos de contra-ordenação que estabelece as condições pelas quais determinados organismos prejudiciais, vegetais, produtos vegetais e Sem prejuízo das competências atribuídas por lei às outros materiais podem ser introduzidos ou circular na autoridades policiais e fiscalizadoras, o levantamento Comunidade ou em zonas protegidas para fins expe- dos autos e a instrução dos processos de contra-orde- rimentais ou científicos e trabalhos de selecção de nação são da competência da DRAP da região em cuja variedades. área foi praticada a contra-ordenação, competindo ao Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4073 director-geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural ANEXO I a aplicação das coimas e sanções acessórias. Esquema de ensaio para diagnóstico, detecção e identifica- ção da bactéria responsável pela podridão anelar da bata- teira, Clavibacter michiganensis (Smith) Davis et al. ssp. Artigo 15.o sepedonicus (Spieckermann e Kotthoff) Davis et al., para efeitos do presente anexo designada por C. m. subsp. Produto das coimas sepedonicus. O produto das coimas reverte: Âmbito do esquema de ensaio a) Em 10 % para a entidade que levantou o auto O esquema de ensaio apresentado descreve os vá- de contra-ordenação; rios procedimentos envolvidos: b) Em 10 % para a entidade que instruiu o processo; c) Em 20 % para a entidade que aplicou a coima; i) No diagnóstico da podridão anelar em tubérculos d) Em 60 % para o Estado. e plantas de batateira; ii) Na detecção de C. m. subsp. sepedonicus em amostras de tubérculos e plantas de batateira; CAPÍTULO IV iii) Na identificação de C. m. subsp. sepedonicus. Disposições finais Princípios gerais: Nos apêndices são apresentados os protocolos opti- Artigo 16.o mizados para os diversos métodos, reagentes valida- Aplicação às Regiões Autónomas dos e pormenores relativos à preparação dos materiais para realização dos testes e para os controlos. O apên- 1 — Sem prejuízo das competências atribuídas à dice n.º 1 apresenta uma lista dos laboratórios que DGADR na qualidade de autoridade fitossanitária foram incluídos na optimização e validação dos pro- nacional, as competências atribuídas pelo presente tocolos. decreto-lei às DRAP são exercidas nas Regiões Autó- Visto que os protocolos envolvem a detecção de um nomas dos Açores e da Madeira pelos organismos dos organismo de quarentena e incluem a utilização de departamentos regionais competentes. 2 — As competências previstas no artigo 14.o são exer- culturas viáveis de C. m. subsp. sepedonicus como cidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira materiais de controlo, é necessário executar os proce- pelos organismos definidos pelos órgãos de governo dimentos sob condições de quarentena adequadas, em próprio. instalações com sistemas apropriados de eliminação de 3 — As percentagens previstas no artigo 15.o prove- resíduos e possuindo as licenças adequadas emitidas nientes das coimas aplicadas nas Regiões Autónomas pelas autoridades oficiais competentes em matéria de dos Açores e da Madeira constituem receita própria quarentena fitossanitária. de cada uma delas. Os parâmetros dos ensaios devem assegurar níveis de detecção de C. m. subsp. sepedonicus consistentes Artigo 17.o e reprodutíveis nos limiares definidos para os méto- Norma revogatória dos seleccionados. É primordial a preparação rigorosa dos controlos É revogada a Portaria n.o 140/95, de 9 de Fevereiro. positivos. A realização dos ensaios de acordo com os limia- Artigo 18.o res exigidos implica também uma correcta regulação, manutenção e calibração do equipamento, manusea- Remissão mento e preservação cuidadosos dos reagentes e esta- Todas as referências feitas para a portaria que agora belecimento de todas as medidas destinadas a evitar a se revoga consideram-se feitas para o presente decre- contaminação entre amostras, por exemplo, a separa- to-lei. ção dos controlos positivos das amostras a testar. De- vem ser aplicadas normas de controlo de qualidade no Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 3 de Maio de 2007. — José Sócrates Carvalho Pinto de sentido de evitar erros administrativos e outros, em Sousa — Luís Filipe Marques Amado — Fernando Tei- especial relativamente à rotulagem e documentação. xeira dos Santos — Alberto Bernardes Costa — Francisco Uma ocorrência suspeita, tal como referido no n.º 1 Carlos da Graça Nunes Correia — Manuel António do artigo 5.º, implica um resultado positivo nos testes Gomes de Almeida de Pinho — Jaime de Jesus Lopes de diagnóstico ou de rastreio numa amostra, tal como Silva. especificado nos fluxogramas. Caso o primeiro teste de rastreio (IF ou PCR/FISH) Promulgado em 11 de Junho de 2007. seja positivo, suspeita-se, então, de contaminação por C. m. subsp. sepedonicus e deve efectuar-se um se- Publique-se. gundo teste de rastreio. Se o segundo teste de rastreio O Presidente da República, ANÍBAL CAVACO SILVA. for positivo, confirma-se, então, a suspeita (ocorrên- cia suspeita) e devem continuar-se os testes de acordo Referendado em 14 de Junho de 2007. com o esquema. Caso o segundo teste de rastreio seja O Primeiro-Ministro, José Sócrates Carvalho Pinto de negativo, a amostra é, então, considerada não conta- Sousa. minada por C. m. subsp. sepedonicus. 4074 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 Por isso, tal como referido na alínea b) do n.º 1 do 1.2. — Esquema para detecção e identificação de C. artigo 5.º, um teste IF positivo é definido por uma lei- m. subsp. sepedonicus em amostras de tubérculos de tura IF positiva confirmada por um segundo teste de batateira assintomáticos: rastreio (PCR/FISH). Princípio: A presença confirmada, tal como referido no n.º 1 O procedimento laboratorial destina-se à detecção de do artigo 6.º, implica o isolamento e identificação de infecções latentes em tubérculos de batateira. Um re- uma cultura pura de C. m. subsp. sepedonicus com sultado positivo em, pelo menos, dois testes de ras- confirmação de patogenicidade. treio baseados em princípios biológicos distintos tem 1. — Apresentação do Fluxograma: de ser complementado pelo isolamento do patogéneo, 1.1. — Esquema para o diagnóstico de podridão seguido de, em caso de isolamento de colónias típi- anelar em tubérculos e plantas de batateira que apre- cas, confirmação da identificação da cultura pura como sentem sintomas de podridão anelar: sendo de C. m. subsp. sepedonicus. Um resultado O procedimento laboratorial destina-se à análise de positivo em apenas um dos testes de rastreio não é tubérculos e plantas de batateira que apresentem sinto- suficiente para considerar a amostra como suspeita. mas típicos ou suspeitos de podridão anelar. Compre- Os testes de rastreio e de isolamento devem permi- ende um teste rápido de rastreio, isolamento do patogé- tir um limiar de detecção de 103 a 104 células por ml neo a partir de tecido vascular infectado em meios de de sedimento ressuspenso, incluídas como controlos cultura adequados e, em caso de resultado positivo, iden- positivos em cada série de testes. tificação da cultura como C. m. subsp. sepedonicus. Amostra de tubérculos de batateira (1) Tubérculo(s) ou plantas de batateira(s) com sintomas suspeitos de podridão anelar (1) Extracção e concentração do patogéneo (2) TESTES RÁPIDOS DE DIAGNÓSTICO (2) TESTES ESSENCIAIS DE RASTREIO (3) Teste IF (4)/ Teste PCR (5)/ Teste FISH (6) TESTE ESSENCIAL DE ISOLAMENTO (3) Primeiro teste de rastreio (3) C. m. subsp. sepedonicus não detectado Negativo Amostra não infectada por C. m. subsp. sepedonicus Colónias com morfologia típica (4) Positivo C. m. subsp. sepedonicus não detectado – Segundo teste de rastreio (3) NÃO (5) amostra não infectada por C. m. subsp. sepedonicus não detectado C. m. subsp. sepedonicus Negativo Amostra não infectada por C. m. subsp. sepedonicus SIM Positivo Isolamento selectivo (7) e/ou bioensaio (8) Purificar através de subcultura Colónias com morfologia típica (9) C. m. subsp. sepedonicus não detectado TESTES DE TESTE DE NÃO (10) Amostra não infectada por IDENTIFICAÇÃO (6) PATOGENICIDADE (7) C. m. subsp. sepedonicus SIM Purificar através de subcultura Ambos os testes confirmam a cultura pura como sendo de C. m. subsp. sepedonicus TESTES DE TESTE DE IDENTIFICAÇÃO (11) PATOGENICIDADE (12) NÃO Amostra não infectada por Ambos os testes confirmam a cultura pura como C. m. subsp. sepedonicus sendo de C. m. subsp. sepedonicus Amostra não infectada por SIM NÃO C. m. subsp. sepedonicus SIM Amostra infectada por Amostra infectada por C. m. subsp. sepedonicus C. m. subsp. sepedonicus (1) A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos, apesar (1) A descrição dos sintomas é apresentada n.º 1. de o procedimento poder ser utilizado com amostras mais peque- (2) O testes adequados são: nas caso não se disponha de 200 tubérculos. Teste IF (n.º 4); (2) Os métodos de extracção e concentração do patogéneo são Teste PCR (n.º 6); descritos no n.º 3.1. Teste FISH (n.º 5). (3) Se, pelo menos, dois testes baseados em princípios biológi- cos diferentes forem positivos, deve proceder-se ao isolamento e à (3) Embora o isolamento por diluição em placas do patogéneo confirmação. Efectuar, pelo menos, um teste de rastreio. Sempre proveniente de material vegetal que apresente sintomas típicos seja que este teste for negativo, a amostra é considerada negativa. Caso simples, poderá não ser possível isolar a bactéria a partir de ma- este teste se revele positivo, são necessários um segundo ou mais terial vegetal em fase avançada de infecção devido à competição testes de rastreio baseados em princípios biológicos diferentes, no e ou excessivo desenvolvimento de colónias de bactérias saprófi- sentido de verificar o primeiro resultado positivo. Caso o segundo tas. Por conseguinte, recomenda-se a utilização de meios de cultu- ra não selectivos e selectivos, de preferência MTNA (n.º 8), bem teste, e qualquer outro dos testes efectuados, sejam negativos, a como de um Bioensaio (n.º 7). amostra é considerada negativa. Não são necessários outros testes. (4) A descrição da morfologia típica da colónia é apresentada no n.º 8. (4) Teste de imunofluorescência (IF). (5) Se o teste de isolamento for negativo, apesar de os sinto- Utilizar sempre para o rastreio por IF um anticorpo policlonal, mas de doença serem típicos, deve repetir-se o isolamento. podendo anticorpos monoclonais adicionais fornecer uma maior (6) Obtém-se uma identificação fiável de uma cultura pura de especificidade (ver n.º 4). C. m. subsp. sepedonicus, através da realização dos testes referi- (5) Teste PCR. dos no n.º 9. Utilizar os reagentes e protocolos PCR adequadamente valida- (7) O teste de patogenicidade é descrito no n.º 10. dos (ver n.º 6). Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4075 (6) Teste FISH. revele positivo, são necessários um segundo ou mais testes de ras- Utilizar reagentes e protocolos validados (ver n.º 5). treio baseados em princípios biológicos diferentes, no sentido de (7) Isolamento selectivo. verificar o primeiro resultado positivo. Caso o segundo teste, e A utilização dos meios MTNA ou NCP-88 e uma diluição de qualquer outro dos testes efectuados sejam negativos, a amostra é 1/100 do sedimento ressuspenso constitui, em muitos casos, um considerada negativa. Não são necessários outros testes. método adequado para o isolamento directo de C. m. subsp. sepe- (4) O teste de isolamento selectivo e a morfologia típica das donicus. Podem obter-se colónias típicas 3 a 10 dias após dilui- colónias são descritos no n.º 8. ção em placas. Nessa altura, o patogéneo pode ser purificado e (5) O teste IF é descrito no n.º 4. identificado. Para tirar o máximo partido das suas capacidades, o (6) O teste PCR descrito no n.º 6. teste requer uma preparação cuidada dos cones dos hilos, de for- (7) O teste FISH é descrito no n.º 5. (8) O bioensaio é descrito no n.º 7. ma a evitar a proliferação de bactérias saprófitas associadas aos (9) O isolamento ou os bioensaios podem conduzir à obtenção tubérculos da batateira, bactérias essas que são concorrentes com de falsos resultados negativos devido à competição ou inibição por C. m. subsp. sepedonicus nos meios e que podem desenvolver-se bactérias saprófitas. Caso se obtenham resultados positivos nos em maior número do que o patogéneo. Caso o teste de diluição testes de rastreio, mas os testes de isolamento sejam negativos, em placas não seja bem sucedido, deve efectuar-se o isolamento a devem repetir-se os testes de isolamento e, se necessário, analisar partir das plantas utilizadas no bioensaio (ver n.º 6). amostras adicionais. (8) O bioensaio é utilizado para o isolamento de C. m. subsp. (10) Consegue-se a identificação fiável de presumíveis culturas sepedonicus a partir de sedimentos de extractos de batateira, atra- puras de C. m. subsp. sepedonicus, através da utilização dos tes- vés de um enriquecimento selectivo em beringelas (Solanum me- tes referidos no n.º 9. longena). O teste requer condições óptimas de incubação, especi- (11) O teste de patogenicidade é apresentado no n.º 10. ficadas neste método. Não é provável que bactérias inibidoras de C. m. subsp. sepedonicus nos meios MTNA ou NCP-88 interfi- ram nos resultados deste teste (ver n.º 7). (9) A morfologia típica das colónias é descrita no n.º 8. 2 — Observação visual dos sintomas de podridão (10) O isolamento ou os bioensaios podem conduzir à obtenção anelar: de falsos resultados negativos devido à competição ou inibição por 2.1 — Plantas de batateira: bactérias saprófitas. Caso se obtenham resultados positivos claros Tendo em conta as condições climáticas europeias, nos testes de rastreio, mas os testes de isolamento sejam negati- vos, devem repetir-se os testes de isolamento a partir do mesmo os sintomas raramente se observam no campo e, fre- sedimento ou através da colheita de tecido vascular adicional da quentemente, apenas no final do ciclo vegetativo. Além zona do hilo de tubérculos já cortados da mesma amostra e, se disso, os sintomas são frequentemente mascarados ou necessário, analisar amostras adicionais. confundidos com os provocados por outras doenças, (11) Consegue-se a identificação fiável de presumíveis culturas puras de C. m. subsp. sepedonicus, através da utilização dos tes- ou causados por senescência ou ainda por danos me- tes referidos no n.º 9. cânicos. Por este motivo, pode não ser fácil detectar (12) O teste de patogenicidade é apresentado no n.º 10. os sintomas no decurso das inspecções de campo. Os sintomas de murchidão são muito diferentes dos cau- 1.3 — Esquema para detecção e identificação de sados pelo pus ou mal murcho; a murchidão é nor- C. m. subsp. sepedonicus em amostras de plantas de malmente lenta e limita-se inicialmente às margens da batateira assintomáticas: folha. As folhas novas infectadas continuam frequen- temente a expandir-se, apesar de esta expansão ser Amostra de segmentos de caule de batateira (1) menor nas zonas infectadas. Este fenómeno dá origem Extracção e concentração do patogéneo (2) a folhas com formatos fora do normal. As folhas afec- tadas pela obstrução dos tecidos vasculares localiza- TESTES ESSENCIAIS DE RASTREIO (3) Isolamento selectivo (4) Teste IF(5)/Teste PCR (6)/Teste FISH (7) dos em zonas inferiores do caule desenvolvem com Teste auxiliar opcional: bioensaio (8) frequência, entre as nervuras, áreas cloróticas, amare- Colónias com morfologia típica (4) Resultados negativos em las a alaranjadas. Os folíolos, as folhas desenvolvidas após isolamento todos os testes efectuados e até os caules infectados podem, eventualmente, mor- NÃO (9) C. m. subsp. sepedonicus não detectado – rer. Frequentemente, as folhas e os tubérculos podem amostra não infectada por C. m. subsp. sepedonicus apenas apresentar um tamanho reduzido. Ocasional- SIM mente, as plantas apresentam nanismo. Podem encon- Purificar através de subcultura trar-se imagens a cores de um conjunto de sintomas no sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/ TESTES DE TESTE DE IDENTIFICAÇÃO (10) PATOGENICIDADE (11) Home/main. 2.2 — Tubérculos de batateira: Ambos os testes confirmam a cultura pura como sendo de C. m. subsp. sepedonicus Os primeiros sintomas observam-se nos tecidos que envolvem o anel vascular, particularmente nas imedia- NÃO Amostra não infectada por C. m. subsp. sepedonicus ções da zona do hilo, que se apresentam ligeiramente SIM vidrados ou translúcidos, sem podridões. O anel vas- cular à volta do hilo pode ter uma cor ligeiramente Amostra infectada por C. m. subsp. sepedonicus mais escura do que o normal. O primeiro sintoma facil- mente identificável é a coloração amarelada do anel (1) Ver n.º 3.2 para a dimensão recomendada das amostras. vascular e, quando se pressiona suavemente o tubér- (2) Os métodos de extracção e concentração do patogéneo são descritos no n.º 3.2. culo, emerge dos vasos um exsudado sob a forma de (3) Caso, pelo menos, dois testes baseados em princípios bioló- fitas. Esta exsudação contém milhões de bactérias. O gicos diferentes sejam positivos, tem de se efectuar o isolamento tecido vascular pode tornar-se acastanhado e os sinto- do patogéneo e a confirmação da sua identificação. Efectuar, pelo menos, um teste de rastreio. Sempre que este teste mas no tubérculo, nesta fase, são semelhantes aos do for negativo, a amostra é considerada negativa. Caso este teste se pus ou mal murcho provocado por Ralstonia solana- 4076 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 cearum. No início, estes sintomas podem limitar-se a Caso se observem sintomas suspeitos de podridão uma parte do anel, não necessariamente perto do hilo, anelar durante a remoção do cone da zona do hilo, o e, em seguida, podem progredir gradualmente, atingin- tubérculo em questão deve ser visualmente inspeccio- do todo o anel. À medida que a infecção progride, dá- nado após o corte próximo do hilo. Qualquer tubércu- -se a destruição do tecido vascular e o córtex externo lo cortado exibindo sintomas suspeitos deverá ser su- pode separar-se do córtex interno. Nos estádios mais berizado durante 2 dias à temperatura ambiente e avançados da infecção, surgem fissuras na superfície armazenado em quarentena (entre 4° a 10°C) até to- do tubérculo, frequentemente castanhas/avermelhadas dos os testes terem sido concluídos. Todos os tubér- nas margens. Registaram-se recentemente na Europa culos da amostra (incluindo os que apresentam sinto- vários casos em que o córtex central apodrece ao mas suspeitos) devem ser conservados de acordo com mesmo tempo que o anel vascular, o que resulta numa o disposto no anexo II. invasão secundária com perfurações internas e necro- 3.1.2 — Colocar os cones dos hilos em recipientes ses. Os sintomas podem ser camuflados por invasões descartáveis não utilizados que possam ser fechados e por fungos ou bactérias secundárias, e pode ser difí- ou selados (caso os recipientes sejam reutilizados de- cil, ou mesmo impossível, distinguir os sintomas da vem ser cuidadosamente limpos e desinfectados com podridão anelar numa fase avançada de qualquer ou- compostos de cloro). Os cones dos hilos devem ser, tra podridão dos tubérculos. Existe a possibilidade de de preferência, processados de imediato. Se tal não for se verificarem sintomas atípicos. Podem encontrar-se possível, devem ser mantidos no recipiente, sem adi- imagens a cores de um conjunto de sintomas no sítio ção de tampão, em local refrigerado durante, no má- web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/ ximo, 72 horas ou 24 horas à temperatura ambiente. main. A secagem e a suberização dos cones, bem como o 3 — Preparação da amostra: 3.1 — Tubérculos de batateira: desenvolvimento de saprófitas durante o armazenamen- to, podem impedir a detecção da bactéria causadora Nota. — A dimensão normal da amostra é de 200 da doença da podridão anelar. tubérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva 3.1.3 — Processar os cones dos hilos de acordo com exige a realização de mais testes em amostras desta um dos seguintes procedimentos: dimensão. Uma amostra com um maior número de a) Cobrir os cones com um volume suficiente (cer- tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior ca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 3) dificuldade em termos de interpretação dos resultados. e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) du- Contudo, este procedimento pode ser aplicado a amos- rante 4 horas a uma temperatura inferior a 24°C ou tras com menos de 200 tubérculos, sempre que este durante 16-24 horas refrigerados; ou número de tubérculos não se encontre disponível. b) Homogeneizar os cones com um volume sufi- A validação de todos os métodos de detecção abai- ciente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apên- xo descritos tem por base a análise de amostras cons- dice n.º 3) num misturador (por exemplo, Waring Blen- tituídas por 200 tubérculos. der ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco O extracto de batata descrito em seguida pode tam- de maceração descartável selado (por exemplo, Stoma- bém ser utilizado para a detecção da bactéria Ralsto- cher ou Bioreba em polietileno resistente, de 150 mm nia solanacearum, bactéria responsável pela doença do x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um pus ou mal murcho da batateira. macete de borracha ou um instrumento de trituração adequado (por exemplo, Homex). Pré-tratamento opcional antes da preparação da amostra: Lavar os tubérculos. Utilizar os desinfectantes (com- Nota. — O risco de contaminação cruzada das amos- postos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR, tras é elevado quando estas são homogeneizadas com para destruir ADN de organismos saprófitas) e deter- recurso a um misturador. Tomar as precauções neces- gentes adequados entre cada amostra. Secar os tubér- sárias para evitar a formação de aerossóis ou derra- culos ao ar. Este procedimento de lavagem é útil (mas mes durante o processo de extracção. Assegurar-se de não obrigatório), em especial para amostras que apre- que as lâminas e os recipientes do misturador utiliza- sentam um excesso de terra e quando se pretender dos para cada amostra foram recentemente esteriliza- utilizar um teste PCR ou um isolamento directo. dos. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contamina- 3.1.1 — Remover a epiderme na zona do hilo de ção por ADN dos recipientes ou instrumento de cada tubérculo com um bisturi ou faca de cortar legu- trituração. Sempre que se utilize o teste PCR, mes, limpos e desinfectados, para que o tecido vascu- recomenda-se a trituração em sacos descartáveis e a lar fique visível. Retirar cuidadosamente um pequeno utilização de tubos descartáveis. cone de tecido vascular na zona do hilo, reduzindo ao mínimo a quantidade de tecido não vascular (ver sítio 3.1.4 — Decantar o sobrenadante. Caso se encon- web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/ tre excessivamente turvo, clarificar através de centri- main. fugação a baixa velocidade (a não mais de 180 g du- rante 10 minutos a uma temperatura entre 4 e 10°C) Nota. — Pôr de lado qualquer tubérculo que exiba ou de filtração por vácuo (40-100 μm), lavando o fil- sintomas suspeitos de podridão anelar e testá-los se- tro com tampão de extracção adicional (10 ml) (apên- paradamente. dice n.º 3). Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4077 3.1.5 — Concentrar a fracção bacteriana por centri- possível, armazenar os segmentos de caule refrigera- fugação a 7000g durante 15 minutos (ou 10000 g dos durante, no máximo, 72 horas ou 24 horas à tem- durante 10 minutos) a uma temperatura compreendida peratura ambiente. entre 4 e 10°C e desprezar o sobrenadante sem per- turbar o sedimento. 3.2.3 — Decantar o sobrenadante após 15 minutos 3.1.6 — Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de de repouso. tampão de ressuspensão (apêndice n.º 3). Utilizar 500μl 3.2.4 — Não é normalmente necessário proceder à para o teste de detecção de C. m. subsp. sepedonicus, clarificação do extracto ou à concentração da fracção 500μl para o teste de detecção de Ralstonia solanace- bacteriana, mas estes objectivos podem alcançar-se arum e 500μl para fins de referência. Adicionar glice- através de filtração e ou centrifugação, tal como des- rol esterilizado até obter uma concentração final de 10- crito nos n.os 3.1.4 a 3.1.6. -25% (v/v) aos 500μl das alíquotas de referência e à 3.2.5 — Dividir o extracto puro ou concentrado da alíquota remanescente da amostra em estudo; agitar em amostra em duas partes iguais. Manter uma metade a vórtice e armazenar entre -16 e –24°C (semanas) ou uma temperatura de 4 a 10°C durante a realização dos entre –68 e –86°C (meses). Manter a alíquota rema- testes e armazenar a outra metade com 10-25% (v/v) nescente da amostra em estudo a uma temperatura de glicerol esterilizado a uma temperatura compreen- entre 4 e 10°C durante o período de ensaio. dida entre –16 e –24°C (semanas) ou –68 e –86°C Não se aconselha a congelação e descongelação (meses), caso seja necessário proceder a mais testes. repetidas. 4 — Teste IF: Caso seja necessário transportar o extracto, garantir Princípio: a entrega numa caixa refrigerada num prazo de 24 a A utilização do teste IF como teste de rastreio prin- 48 horas. cipal é recomendada, tendo em conta a sua robustez 3.1.7 — É indispensável que as amostras e os con- comprovada para alcançar os limiares de detecção trolos positivos de C. m. subsp. sepedonicus sejam exigidos. tratados separadamente para evitar contaminações. O Sempre que se utilize o teste IF como teste de ras- mesmo se aplica às lâminas de imunofluorescência e treio principal e o seu resultado seja positivo, tem de a todos os testes. se realizar o teste PCR ou o teste FISH como segun- 3.2 — Plantas de batateira: do teste de rastreio. Sempre que se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja Nota. — Para a detecção de populações latentes de positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com C. m. subsp. sepedonicus, é aconselhável a análise de o fluxograma para completar a análise. amostras compostas. O procedimento pode ser aplica- do convenientemente a amostras compostas contendo Nota. — Utilizar sempre um anticorpo policlonal até 200 partes de caule (sempre que forem realizadas quando o teste IF for usado como principal teste de prospecções, estas devem basear-se numa amostra es- rastreio. No caso de se obter um resultado positivo no tatisticamente representativa da população de plantas teste IF com um anticorpo policlonal, as amostras em estudo.) podem ser submetidas a novos testes com um anticor- po monoclonal que, embora apresente uma maior es- 3.2.1 — Com uma faca ou uma tesoura de poda lim- pecificidade, pode ser menos sensível. pas e desinfectadas, remover um segmente de 1-2 cm Utilizar anticorpos contra uma estirpe de referência da base de cada caule, imediatamente acima do nível de C. m. subsp. sepedonicus. Recomenda-se a deter- do solo. minação do título para cada novo lote de anticorpos. Desinfectar rapidamente os segmentos de caule com O título é definido como a diluição mais elevada para etanol a 70 % e secá-los imediatamente com papel de a qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma filtro. suspensão contendo 105 a 106 células por ml da estir- Recolher os segmentos de caule num recipiente es- pe homóloga de C. m. subsp. sepedonicus, e recorren- terilizado fechado, de acordo com os seguintes proce- do a um conjugado de isotiocianato de fluoresceína dimentos de amostragem: (FITC), de acordo com as recomendações do fabrican- 3.2.2 — Processar os segmentos de caule de acordo te. Os anticorpos policlonais ou monoclonais nativos com um dos seguintes procedimentos: devem possuir um título IF de, pelo menos, 1:2000. Durante o teste, os anticorpos devem ser utilizados em a) Cobrir os segmentos com um volume suficiente diluições de trabalho (DT) próximas do título ou no (cerca de 40ml) de tampão de extracção (apêndice seu valor exacto. Utilizar anticorpos validados (ver sítio n.º 3) e colocá-los num agitador rotativo (50-100rpm) web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/ durante 4 horas a menos de 24°C ou durante 16-24 main). horas em local refrigerado; ou O teste deve ser realizado com extractos de amos- b) Processar imediatamente, esmagando os segmen- tras recentemente preparados. Se necessário, pode ser tos num saco de maceração resistente (por exemplo, executado com sucesso em extractos armazenados en- Stomacher ou Bioreba) com um volume adequado de tre -68 e -86°C e conservados em glicerol. O glicerol tampão de extracção (apêndice n.º 3), com recurso a pode ser retirado da amostra através da adição de 1 ml um macete de borracha ou um instrumento de tritura- de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4), nova cen- ção adequado (por exemplo, Homex). Se tal não for trifugação durante 15 minutos a 7000g e ressuspensão 4078 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 num volume igual de tampão de ressuspensão. Este 4.3 — Procedimento IF: procedimento é frequentemente desnecessário, em es- i) De acordo com a preparação da lâmina descrita pecial se as lâminas forem fixadas à chama (ver na alínea i) do n.º 4.1: n.º 2.2). Preparar um conjunto de diluições a 1/2 do anticor- Preparar lâminas de controlo positivo em separado po em tampão IF. O primeiro poço deve ter 1/2 do com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe título (T/2), os restantes 1/4 do título (T/4), 1/2 do de referência de C. m. subsp. sepedonicus suspensa em título (T/2), o título (T) e o dobro do título (2T). extracto de batata, tal como especificado no apêndice n.º 2 e, opcionalmente, em tampão. ii) De acordo com a preparação da lâmina descrita Sempre que possível, deve também ser utilizado na alínea ii) do n.º 4.1: material vegetal naturalmente infectado (liofilizado Preparar a diluição de trabalho (DT) do anticorpo ou congelado a uma temperatura compreendida en- em tampão IF. A diluição de trabalho afecta a especi- tre –16 e –24°C) como controlo positivo na mesma ficidade. lâmina. Como controlos negativos, utilizar alíquotas de ex- tracto de amostra que anteriormente se tenham revela- FIGURA N.º 1 do negativas relativamente à presença de C. m. subsp. Preparação da lâmina de acordo com a alínea i) do n.º 4.1 sepedonicus. e a alínea i) do n.º 4.3 Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, Diluições do sedimento ressuspenso de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâme- 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Ƒ Diluição do tro cada. sedimento ressuspenso Testar o material de controlo de forma idêntica à T = Título) T/2 T/4 T/2 T 2T Ƒ Diluições 1/2 do da(s) amostra(s). anti-soro/anticorpo 4.1 — Preparar as lâminas através de um dos seguin- Amostra 1 Ɣ1 Ɣ2 Ɣ3 Ɣ4 Ɣ5 tes procedimentos: Duplicado da amostra Ɣ6 Ɣ7 Ɣ8 Ɣ9 Ɣ 10 1 ou amostra 2 i) Para sedimentos com relativamente pouco amido: Pipetar um volume-padrão (15μl é adequado para FIGURA N.º 2 poços com 6 mm de diâmetro — aumentar o volume Preparação da lâmina de acordo com a alínea ii) do n.º 4.1 proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma di- e a alínea ii) do n.º 4.3 luição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso Diluição de trabalho do anti-soro/anticorpo no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume 1/1 1/10 1/100 Vazio Vazio Ƒ Diluição decimal semelhante de sedimento não diluído (1/1) nos restan- do sedimento ressuspenso tes poços da fila. A segunda fila de poços pode ser Amostra 1 Ɣ1 Ɣ2 Ɣ3 Ɣ4 Ɣ5 utilizada como um duplicado ou para outra amostra, Duplicado da Ɣ6 Ɣ7 Ɣ8 Ɣ9 Ɣ 10 como indicado na figura n.º 1. amostra 1 ou amostra 2 ii) Para outros sedimentos: 4.3.1 — Dispor as lâminas sobre papel de filtro Preparar diluições decimais (1/10 e 1/100) do sedi- humedecido. Cobrir por completo cada poço contendo mento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipe- a amostra a testar com a(s) diluição(ões) de anticorpo. tar um volume-padrão (15μl é adequado para poços O volume de anticorpo adicionado a cada poço deve com 6 mm de diâmetro — aumentar o volume propor- ser, pelo menos, igual ao volume de extracto aplica- cionalmente à dimensão dos poços) do sedimento res- do. suspenso e de cada uma das diluições numa fila de O procedimento seguinte deve ser efectuado na au- poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada sência de instruções específicas dos fornecedores dos como um duplicado ou para outra amostra, como in- anticorpos. dicado na figura n.º 2. 4.3.2 — Incubar as lâminas sobre papel de filtro humedecido durante 30 minutos à temperatura ambi- 4.2 — Secar as gotículas à temperatura ambiente ou ente (18 a 25°C) numa caixa fechada. por aquecimento a uma temperatura compreendida 4.3.3 — Sacudir as gotículas da lâmina. Lavar por entre 40 e 45°C. Fixar as células bacterianas na lâ- submersão durante 5 minutos em tampão IF-Tween e mina através de aquecimento (15 minutos a 60°C), à subsequentemente durante 5 minutos em tampão IF chama, com etanol a 95 %, ou em conformidade com (apêndice n.º 3). Evitar a transferência de aerossóis ou instruções específicas dos fornecedores dos anticor- de gotículas, o que poderia dar origem a uma conta- pos. minação cruzada. Eliminar cuidadosamente a humida- Se necessário, as lâminas assim tratadas podem ser de em excesso, secando suavemente com papel absor- armazenadas congeladas numa caixa de dessecação vente. durante o menor tempo possível (até um máximo de 4.3.4 — Dispor as lâminas sobre papel de filtro 3 meses) antes de serem testadas. humedecido. Cobrir os poços contendo as amostras a Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4079 testar com a diluição do conjugado FITC utilizada para Nota. — A leitura do teste IF revela um resultado determinar o título. O volume de conjugado FITC adi- positivo para amostras com, pelo menos, 5 x 103 de cionado aos poços deve ser idêntico ao volume de células típicas por ml de sedimento ressuspenso. A anticorpo utilizado. amostra é considerada como potencialmente contami- 4.3.5 — Incubar as lâminas sobre papel de filtro nada, sendo necessário efectuar outros testes. humedecido durante 30 minutos à temperatura ambi- ente (18 a 25°C) numa caixa opaca fechada. ii) A leitura do teste IF revela um resultado negati- 4.3.6 — Sacudir da lâmina as gotículas de conjuga- vo para amostras com menos de 5 x 103 células por do FITC. Lavar como anteriormente (n.º 4.3.3). ml de sedimento ressuspenso, sendo a amostra consi- Retirar cuidadosamente o excesso de humidade. derada negativa. 4.3.7 — Pipetar para cada poço 5-10μl de uma so- lução de tampão fosfato 0,1M com glicerol (apêndice Nota. — A realização de outros testes não é obri- n.º 3) ou de um líquido de montagem disponível no gatória. mercado que evite a perda rápida de fluorescência e cobrir com uma lamela. 5 — Teste FISH: 4.4 — Leitura do teste IF: Princípio: 4.4.1 — Examinar as lâminas do teste num micros- Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro cópio de epifluorescência, com filtros adequados para teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem excitação do FITC, utilizando uma lente de imersão de se realizar o teste IF como segundo teste obrigató- em óleo ou água, com uma ampliação de 500-1000x. rio de rastreio. Sempre que se utilize o teste FISH Examinar os poços ao longo de dois diâmetros per- como segundo teste de rastreio e o seu resultado seja pendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que positivo, tem de se realizar mais testes de acordo com não revelem células, ou cujo número seja reduzido, ob- fluxograma para completar o diagnóstico. servar, pelo menos, 40 campos do microscópio. Observar primeiro a lâmina do controlo positivo. As Nota. — Utilizar sondas validadas específicas para células devem apresentar-se com uma fluorescência C. m. subsp. sepedonicus (apêndice n.º 7). O teste pre- brilhante e completamente coradas no título do anti- liminar com este método deve permitir a detecção re- corpo ou diluição de trabalho determinados. O teste produtível de, pelo menos, 103-104 células de C. m. IF (n.º 4) deve ser repetido se a coloração for aber- subsp. sepedonicus por ml adicionadas a extractos de rante. amostras que anteriormente se tenham revelado nega- 4.4.2 — Observar células fluorescentes brilhantes tivos. com a morfologia característica de C. m. subsp. sepe- donicus nos poços das lâminas em estudo (ver sítio O procedimento seguinte deverá ser realizado, de web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/ preferência, com um extracto de amostra preparado na main). A intensidade de fluorescência deve ser equi- altura da utilização, mas pode também ser realizado valente à da estirpe do controlo positivo, ou melhor com sucesso com um extracto de amostra que tenha do que esta, para a mesma diluição do anticorpo. As sido armazenado em glicerol a uma temperatura com- células com coloração incompleta ou com fluorescên- preendida entre –16 e –24°C ou –68 e –86°C. cia fraca não devem ser consideradas. Como controlos negativos, utilizar alíquotas de ex- Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste tracto de amostra que tenha anteriormente sido testado deve ser repetido. Este pode ser o caso quando todas com resultado negativo para C. m. subsp sepedonicus. as lâminas de um lote, revelem células positivas devi- Como controlos positivos preparar suspensões con- do à contaminação do tampão ou se forem encontra- tendo 105 a 106 células de C. m. subsp. sepedonicus das células positivas (fora do poço da lâmina) no re- por ml provenientes de uma cultura com 3 a 5 dias vestimento da lâmina. (por exemplo, estirpe NCPPB 4053 ou PD 406) em 4.4.3 — Há vários problemas inerentes à especifici- tampão fosfato (PB) 0,01M (para a preparação ver dade do teste de imunofluorescência. Em sedimentos apêndice n.º 2). Preparar lâminas de controlo positivo de cones de hilo e de segmentos de caule da batatei- em separado com a estirpe homóloga, ou qualquer ra, é possível a ocorrência de populações de células outra estirpe de referência de C. m. subsp. sepedoni- fluorescentes com morfologia atípica e reacções cru- cus suspensa em extracto de batata, tal como especifi- zadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfo- cado no apêndice n.º 2. logia semelhantes a C. m. subsp. sepedonicus. A utilização de sondas para eubactérias marcadas 4.4.4 — Considerar apenas células fluorescentes com com FITC oferece um controlo para o processo de dimensões e morfologia típicas no título ou na dilui- hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na ção de trabalho dos anticorpos, tal como descrito no amostra ficarão coradas. n.º 4.3. Testar o material de controlo de forma idêntica à 4.4.5 — Interpretação do teste IF: da(s) amostra(s). i) Se forem detectadas células fluorescentes brilhan- 5.1 — Fixação do extracto de batata: tes e com a morfologia característica, determinar o O protocolo seguinte tem por base Wullings et al., número médio de células típicas por cada campo do (1998): microscópio e calcular o número de células típicas por 5.1.1 — Preparar a solução fixadora (ver apêndice ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4); n.º 7). 4080 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 5.1.2 — Pipetar 100 μl de cada extracto de amostra mix» (apêndice n.º 7). Pré-incubar a caixa na estufa de para um tubo Eppendorf e centrifugar durante 8 mi- hibridação a 55°C durante, pelo menos, 10 minutos. nutos a 7000g. 5.2.4 — Preparar 45μl de solução de hibridação 5.1.3 — Remover o sobrenadante e dissolver o se- (apêndice n.º 7) por lâmina e pré-incubar durante 5 mi- dimento em 500μl de fixador preparado há menos de nutos a 55°C. 24 horas. Agitar em vortex e incubar até ao dia se- 5.2.5 — Colocar as lâminas sobre uma placa aque- guinte a 4 °C. cida a 45°C e aplicar 10μl de solução de hibridação Etanol a 96 % constitui um fixador alternativo. Para em cada um dos 4 poços da(s) lâmina(s). o utilizar, dissolver o sedimento referido no n.º 5.1.2, 5.2.6 — Aplicar duas lamelas (24 x 24 mm) em cada em 50μl de tampão fosfato 0,01M e 50μl de etanol a lâmina, sem retenção de ar. Colocar as lâminas na 96 %. Agitar em vortex e incubar a 4°C durante 30 a câmara húmida pré-aquecida e hibridar de um dia para 60 minutos. o outro na estufa a 55°C, no escuro. 5.1.4 — Centrifugar durante 8 minutos a 7000g, 5.2.7 — Preparar 3 copos contendo 1 l de água ul- remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em tra pura (UPW), 1 l de 1x «hybmix» (334 ml de 3 x 75μl de tampão fosfato 0,01M (ver apêndice n.º 3). «hybmix» e 666 ml de UPW) e 1 l de ½ x «hybmix» 5.1.5 — Colocar 16μl das suspensões fixadas numa (167 ml de 3x «hybmix» e 833 ml de UPW). Pré-in- lâmina multiteste limpa, tal como demonstrado na fi- cubar cada um deles em banho-maria a 55°C. gura n.º 3. Aplicar duas amostras não diluídas diferen- 5.2.8 — Retirar as lamelas das lâminas e colocar tes por lâmina e utilizar 10μl para obter uma diluição estas últimas no porta-lâminas. de 1:100 (em tampão fosfato 0,01M). A solução de 5.2.9 — Remover as sondas em excesso por incu- amostra restante (49μl) pode ser armazenada a –20°C bação durante 15 minutos no recipiente com 1x «hyb- após adição de 1 volume de etanol a 96 %. Caso o mix» a 55°C. teste FISH exija uma repetição, remover o etanol por 5.2.10 — Transferir o porta-lâminas para uma solu- centrifugação e adicionar igual volume de tampão fos- ção de lavagem com 1/2 de «hybmix» e incubar du- fato 0,01M (agitar em vortex). rante mais 15 minutos. 5.2.11 — Mergulhar as lâminas brevemente em FIGURA N.º 3 UPW e colocá-las sobre papel de filtro. Remover o Configuração para a lâmina FISH excesso de humidade cobrindo a superfície suave- Amostra 1 Branco Branco Branco Amostra 2 mente com papel de filtro. Pipetar 5-10ìl de solu- ż ż ż ż ż ção de montagem que evite uma rápida perda de flu- Poço 1 Poço 2 Poço 3 Poço 4 Poço 5 orescência (por exemplo, Vectashield, Vector Amostra 1 Branco Branco Branco Amostra 2 Laboratories, CA, USA ou equivalente) em cada ż ż ż ż ż Poço 6 Poço 7 Poço 8 Poço 9 Poço 10 poço e aplicar uma lamela grande (24 × 60 mm) Lamela 1 Lamela 2 cobrindo toda a lâmina. 5.3 — Leitura do teste FISH: 5.1.6 — Secar as lâminas ao ar (ou num secador de 5.3.1 — Observar imediatamente as lâminas com um lâminas a 37 C) e proceder à sua fixação à chama. microscópio equipado para microscopia de epifluores- Nesta fase o procedimento pode ser interrompido e cência, sob lente de imersão em óleo, a uma amplia- a hibridação continuada no dia seguinte. As lâminas ção de 630 ou 1000x. Com um filtro indicado para devem ser armazenadas em local sem poeiras e seco à isotiocianato de fluoresceína (FITC), as células eubac- temperatura ambiente. terianas (incluindo a maior parte das células gram-ne- 5.2 — Pré-hibridação e hibridação: gativas) presentes na amostra mostram uma coloração 5.2.1 — Preparar uma solução de lisozima conten- verde fluorescente. Com um filtro para isotiocianato- do 10mg de lisozima (Sigma L-6876) em 10ml de tam- -5-tetrametilrodamina, as células de C. m. subsp. se- pão (Tris-HCl 100mM, EDTA 50mM, pH 8,0). Esta pedonicus coradas com Cy3 revelam-se vermelho flu- solução pode ser armazenada mas deverá ser congela- orescente. Comparar a morfologia das células com a da/descongelada apenas uma vez. Cobrir cada poço de dos controlos positivos. As células devem apresentar- amostra com cerca de 50μl de solução de lisozima e -se com uma fluorescência brilhante e completamente incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. coradas. O teste FISH (n.º 9.4) deve ser repetido se a Mergulhar então as lâminas em água desmineralizada coloração for aberrante. Examinar os poços ao longo apenas uma vez e secar com papel de filtro. de dois diâmetros perpendiculares e à volta do perí- Alternativamente, em vez de lisozima, adicionar metro. Para amostras que não revelem células, ou cujo 50 μl de uma solução de proteinase K 40-400μgml-1 número seja reduzido, observar, pelo menos, 40 cam- em tampão (Tris HCl 20mM, CaCl2 2mM, pH 7,4) a pos do microscópio. cada poço e incubar a 37°C durante 30 minutos. 5.3.2 — Procurar células fluorescentes brilhantes 5.2.2 — Desidratar as células num gradiente de con- com a morfologia característica de C. m. subsp. sepe- centrações de etanol de 50 %, 80 % e 96 % durante 1 donicus nos poços das lâminas de teste (ver sítio web minuto cada. Secar as lâminas ao ar num porta-lâmi- http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). nas. A intensidade de fluorescência deve ser equivalente ou 5.2.3 — Preparar uma câmara de incubação húmi- superior à da estirpe do controlo positivo. As células da, cobrindo o fundo de uma caixa hermética com com coloração incompleta ou com fluorescência fraca papel absorvente ou de filtro embebido em 1x «hyb- não devem ser consideradas. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4081 5.3.3 — Caso se suspeite de qualquer contaminação, riormente resultados negativos. Poderão ser necessári- o teste deve ser repetido. Este poderá ser o caso quan- as experiências de optimização para alcançar os níveis do todas as lâminas de um lote revelem células posi- máximos de sensibilidade e especificidade em todos os tivas devido à contaminação do tampão ou se forem laboratórios. encontradas células positivas (fora do poço da lâmi- Utilizar reagentes e protocolos PCR validados. Se- na) no revestimento da lâmina. leccionar, de preferência, um método que disponha de 5.3.4 — Há vários problemas inerentes à especifici- um controlo interno. dade do teste FISH. Em sedimentos de cones de hilos Tomar as precauções necessárias para evitar a con- e de segmentos de caule da batateira, é provável a taminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR ocorrência de populações de células fluorescentes com deverá ser realizado por técnicos experimentados, em morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias laboratórios dedicados à biologia molecular, no senti- saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes a do de minimizar a possibilidade de contaminação com C. m. subsp. sepedonicus, apesar de este fenómeno ser ADN-alvo. menos frequente do que no teste IF. 5.3.5 — Considerar unicamente as células fluores- Os controlos negativos (para os procedimentos de centes de dimensões e morfologia típicas, ver n.º 5.3.2. extracção de ADN e PCR) devem ser sempre mani- 5.3.6 — Interpretação do resultado do teste FISH: pulados como amostras finais no procedimento, a fim i) Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação quando se observarem, com um filtro para FITC, cé- com ADN. lulas brilhantes com fluorescência verde de dimensões Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes con- e morfologia típicas de C. m. subsp. sepedonicus e, trolos negativos: com o filtro para rodamina, células brilhantes com flu- orescência vermelha em todos os controlos positivos, Extracto de amostra que tenha anteriormente sido as quais deverão estar ausentes em todos os controlos testado e se tenha revelado negativo relativamente à negativos. Se forem detectadas células fluorescentes presença de C. m. subsp. sepedonicus; brilhantes e com a morfologia característica, determi- Controlos dos tampões utilizados para extrair a bac- nar o número médio de células típicas por cada cam- téria e o ADN da amostra; po do microscópio e calcular o número de células tí- Mistura de reacção da PCR. picas por ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4). As amostras com, pelo menos, 5x 103 células típicas Devem ser incluídos os seguintes controlos positi- por ml de sedimento ressuspenso são consideradas vos: como potencialmente contaminadas. A realização de Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se outros testes é obrigatória. As amostras com menos de adicionou C. m. subsp. sepedonicus (ver preparação no 5x 103 células típicas por ml de sedimento ressuspen- apêndice n.º 2); so são consideradas negativas; Uma suspensão em água contendo106 células por ml ii) O teste FISH é negativo se não se observarem, de um isolado virulento (por exemplo, NCPPB 2140 com um filtro para rodamina, células brilhantes com ou NCPPB 4053) de C. m. subsp. sepedonicus; fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típi- Se possível, utilizar também ADN extraído de amos- cas de C. m. subsp. sepedonicus, mas sejam observa- tras de controlo positivas no teste PCR. das células típicas brilhantes com fluorescência verme- lha nas preparações de controlo positivo mediante a Nota. — Para evitar uma potencial contaminação, os utilização do filtro para rodamina. controlos positivos devem ser preparados num ambi- 6 — PCR: ente separado do das amostras a serem testadas. Princípios: Sempre que se utilize a PCR como teste de rastreio Os extractos de amostras devem estar, o mais pos- principal e o seu resultado seja positivo, tem de se sível, isentas de terra. Seria, por isso, em alguns ca- realizar o teste IF como segundo teste obrigatório de sos, mais prudente preparar as extracções a partir de rastreio. Sempre que se utilize o teste PCR como se- batatas lavadas, caso se utilizem os testes PCR.. gundo teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, 6.1 — Métodos de purificação do ADN: tem de se realizar mais testes de acordo com o fluxo- Utilizar amostras de controlo positivo e negativo, tal grama para completar o diagnóstico. como descrito anteriormente. A exploração completa deste método como teste de Preparar o material de controlo de forma idêntica à rastreio principal é apenas recomendada quando tenham da(s) amostra(s). sido adquiridos conhecimentos altamente especializa- Existe uma variedade de métodos para a purifica- dos. ção do ADN-alvo a partir de amostras de substratos complexos, removendo, deste modo, os inibidores da Nota. — Os testes preliminares com este método PCR e outras reacções enzimáticas e concentrando o deveriam permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 ADN-alvo no extracto de amostra. células de C. m. subsp. sepedonicus por ml adiciona- O método seguinte foi optimizado para utilização das a amostras de extractos que apresentaram ante- com o teste PCR validado, referido no apêndice n.º 6. 4082 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 6.1 — a) Método segundo Pastrick (2000): tocolo da PCR validado é uma reacção multiplex que incorpora também um controlo interno da PCR. 1) Pipetar 220μl de tampão de lise (NaCl 100mM, Tris-HCl 10mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) para 6.2.3 — Adicionar 5μl de extracto de ADN à mis- um tubo Eppendorf de 1,5ml; tura de reacção da PCR de forma a obter um volume 2) Adicionar 100μl de extracto de amostra e colo- final de 25μl em tubos PCR esterilizados. car num bloco de aquecimento ou em banho-maria a 6.2.4 — Incorporar uma amostra de controlo nega- 95°C durante 10 minutos; tivo contendo apenas a mistura de reacção da PCR e 3) Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos, adicionar a mesma fonte de UPW utilizada na mistura 4) Adicionar 80μl de solução concentrada de liso- da PCR em substituição da amostra. zima (50mg de lisozima por ml em Tris HCl 10mM, 6.2.5 — Colocar os tubos no mesmo termociclador pH 8,0) e incubar a 37°C durante 30 minutos; que foi utilizado no teste preliminar e iniciar o pro- 5) Adicionar 220 μl de solução A Easy DNA® (In- grama optimizado da PCR adequado (apêndice n.º 6). vitrogen), misturar bem em vórtice e incubar a 65°C 6.3 — Análise do produto da PCR: durante 30 minutos; 6.3.1 — Proceder à electroforese em gel de agarose 6) Adicionar 100μl de solução B Easy DNA® (In- dos fragmentos amplificados pela PCR. Correr, pelo vitrogen), agitar vigorosamente em vortex até que o menos, 12μl de mistura de reacção contendo o ADN precipitado se desloque livremente no tubo e a amos- amplificado de cada uma das amostras, misturados com tra esteja uniformemente viscosa; 3μl de tampão de carregamento (apêndice n.º 6), em 7) Adicionar 500μl de clorofórmio e agitar em vor- géis de agarose a 2 % (p/v) em tampão de tris acetato- tex até que a viscosidade diminua e a mistura se tor- -EDTA (TAE) (apêndice n.º 6) a 5-8 V por cm. Utili- ne homogénea; zar um marcador de ADN adequado, por exemplo 8) Centrifugar a 15000g durante 20 minutos a 4°C 100bp DNA ladder. para separar as fases e formar a interfase; 6.3.2 — Revelar as bandas de ADN através de co- 9) Transferir a fase superior para um tubo Eppen- loração em brometo de etídio (0,5mg por l) durante dorf limpo, 30-45 minutos, tomando as precauções adequadas para 10) Adicionar 1ml de etanol a 100 % (-20°C) agi- manusear este agente mutagénico. tar brevemente em vortex e incubar no gelo durante 6.3.3 — Observar o gel corado num transiluminador 10 minutos, com UV de ondas curtas (por exemplo, ë = 302 nm) 11) Centrifugar a 15000g durante 20 minutos a 4°C para detecção de produtos amplificados da PCR de e remover o etanol do sedimento; tamanho esperado (apêndice n.º 6) e documentar. 12 ) Adicionar 500μl de etanol a 80 % (-20°C) e 6.3.4 — Para todas as novas detecções/situações, misturar invertendo o tubo; verificar a autenticidade do fragmento amplificado pela 13) Centrifugar a 15000g durante 10 minutos a 4°C, PCR através da realização de análise de restrição en- guardar o sedimento e remover o etanol; zimática na amostra do ADN amplificado restante, por 14) Deixar secar o sedimento ao ar ou em «DNA incubação com uma enzima de restrição e um tampão speed vac»; adequados à temperatura e com duração óptimas (apên- 15) Ressuspender o sedimento em 100μl de UPW dice n.º 6). Proceder em seguida, tal como anteriormen- esterilizada e deixar à temperatura ambiente durante, te, à electroforese em gel de agarose dos fragmentos pelo menos, 20 minutos; digeridos e observar o padrão dos fragmentos de res- 16) Armazenar a -20°C até ser necessário para a trição característico num transiluminador com UV, após realização da PCR; coloração com brometo de etídio, e comparar com o 17) Centrifugar qualquer precipitado branco até que controlo positivo não digerido e digerido. este se deposite no fundo e utilizar 5μl do sobrena- Interpretação do resultado do teste PCR: dante contendo ADN para a PCR. O teste PCR é considerado negativo caso não seja detectado o fragmento amplificado pela PCR de tama- 6.1 — b) Outros métodos: nho específico esperado para C. m. subsp. sepedoni- Podem ser aplicados outros métodos de extracção cus para a amostra em estudo, mas seja detectado em de ADN (por exemplo, Qiagen DNeasy Plant Kit), todas as amostras de controlo positivo (no caso da PCR desde que esteja provado que são igualmente efica- multiplex com iniciadores de controlo interno especí- zes na purificação do ADN a partir de amostras de ficos para as plantas, deverá ser detectado um segun- controlo contendo 10 3 a 10 4 células do patogéneo do produto da PCR de tamanho esperado na amostra por ml. em estudo). O teste PCR é considerado positivo caso seja de- 6.2 — PCR: tectado o fragmento amplificado pela PCR específico 6.2.1 — Preparar as amostras a testar e controlos para C. m. subsp. sepedonicus de tamanho e padrão para a PCR em conformidade com o protocolo vali- de restrição esperados (quando necessário), desde que dado (apêndice n.º 6). Preparar uma diluição decimal não seja amplificado a partir de nenhuma das amos- de extracto de ADN da amostra (1:10 em UPW). tras de controlo negativo. A confirmação fiável de um 6.2.2 — Preparar a mistura adequada de reacção da resultado positivo pode também ser obtida mediante a PCR num ambiente isento de contaminação, de acor- repetição do teste com um segundo conjunto de inicia- do com o protocolo publicado (apêndice n.º 6). O pro- dores da PCR (n.º 9.3). Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4083 Nota. — Pode suspeitar-se de inibição da PCR se o 7.4 — Inoculação por injecção: fragmento amplificado esperado for observado na Inocular os caules das beringelas imediatamente amostra de controlo positivo de uma suspensão aquo- acima dos cotilédones, utilizando uma seringa com sa de C. m. subsp. sepedonicus, mas se obtenham re- uma agulha hipodérmica (não inferior a 23 G). Distri- sultados negativos de controlos positivos de C. m. buir o sedimento pelas beringelas. subsp. sepedonicus em extracto de batata. Nos proto- 7.5 — Como controlos positivos, inocular 5 plantas colos da PCR multiplex com controlos internos da com uma suspensão aquosa de 105 a 106 células por PCR, a inibição da reacção é indicada sempre que não ml de uma cultura conhecida de C. m. subsp. sepedo- se obtenha nenhum dos dois fragmentos amplificados. nicus e, sempre que possível, com tecido de um tu- bérculo naturalmente infectado (ver n.º 4) através da Pode suspeitar-se de contaminação, caso o fragmento mesma técnica de inoculação (n.º 7.3 ou 7.4). amplificado esperado seja obtido em um ou vários dos 7.6 — Como controlos negativos, inocular 5 plan- controlos negativos. tas com tampão de ressuspensão esterilizado, seguin- 7 — Bioensaio: do a mesma técnica de inoculação (n.º 7.3 ou 7.4). 7.7 — Incubar as plantas em instalações de quaren- Nota. — Um teste preliminar com este método deve tena durante um período de até 4 semanas a uma tem- permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 unida- peratura compreendida entre 18 e 24°C. Incubar as des formadoras de colónias de C. m. subsp. sepedoni- plantas com luz suficiente e uma elevada humidade cus por ml adicionadas a amostras de extractos para relativa (70-80 %), regando adequadamente de modo os quais se obtiveram anteriormente resultados negati- a evitar o alagamento ou a murchidão por falta de vos (para a preparação ver apêndice n.º 2). água. As células de C. m. subsp. sepedonicus não re- sistem a temperaturas superiores a 30°C e a tempera- A mais elevada sensibilidade de detecção pode ser tura óptima é de 21°C. Para evitar contaminações, esperada quando se utiliza uma amostra de extracto incubar as plantas de controlo positivo e as de contro- recentemente preparada e condições de crescimento lo negativo em bancadas claramente separadas, numa óptimas. No entanto, o método pode ser aplicado com estufa ou câmara de crescimento ou, mesmo que exis- sucesso a extractos que tenham sido armazenados em tam limitações de espaço, garantir uma separação ri- glicerol a uma temperatura compreendida entre –68 e gorosa entre tratamentos. Se as plantas relativas a –86°C. amostras diferentes tiverem de ser incubadas perto Algumas variedades de beringelas constituem um umas das outras, separá-las com as divisórias adequa- excelente meio de enriquecimento selectivo para o das. Tomar sempre todas as precauções de forma a crescimento de C. m. subsp. sepedonicus, mesmo na evitar contaminações cruzadas ao adubar, regar, ins- ausência de sintomas, proporcionando também um peccionar ou ao efectuar outras manipulações. É es- excelente teste de patogenicidade para confirmação da sencial manter as estufas ou as câmaras de crescimen- identificação da bactéria. to isentas de praga, visto que estas podem transmitir a As condições de cultivo devem ser óptimas para bactéria entre as amostras. reduzir o risco de falsos resultados negativos. 7.8 — Ao fim de uma semana, examinar regularmen- Para os pormenores das condições de cultivo, ver te as plantas para detectar quaisquer sintomas. Contar apêndice n.º 8. o número de plantas que apresentam sintomas. C. m. 7.1 — Distribuir toda a alíquota restante do sedimen- subsp. sepedonicus causa murchidão das folhas da to ressuspenso, descrito nos n.os 3.1.6 ou 3.2.5, pelas beringela, que pode começar sob a forma de flacidez beringelas através de um dos métodos a seguir referi- das margens ou entre as nervuras. O tecido murcho dos (n.º 7.3 ou 7.4). Utilizar apenas plantas que se pode inicialmente apresentar-se verde-escuro ou man- encontrem no estado fenológico de 2-3 folhas, até à chado, tornando-se em seguida mais pálido antes de expansão total da terceira folha verdadeira. De forma ficar necrótico. A murchidão entre as nervuras apre- a assegurar a completa utilização do sedimento ressus- senta frequentemente um aspecto hidrópico. O tecido penso bem como uma inoculação eficaz, os procedi- necrosado apresenta muitas vezes margens de um mentos a seguir mencionados irão requerer a inocula- amarelo vivo. As plantas não morrem forçosamente; ção de 15-25 plantas de beringela por amostra. quanto mais longo for o período antes do aparecimen- 7.2 — Não regar as beringelas 1 a 2 dias antes da to dos sintomas, maior é a probabilidade de sobrevi- inoculação para reduzir a sua turgescência. vência. As plantas podem sobreviver à infecção. As 7.3 — Inoculação por fenda: beringelas jovens são muito mais susceptíveis a bai- 7.3.1 — Segurar a planta entre dois dedos, pipetar xos níveis populacionais de C. m. subsp. sepedonicus uma gota (cerca de 5-10μl) do sedimento ressuspenso do que as plantas mais velhas, pelo que é necessário no caule, entre os cotilédones e a primeira folha. utilizar plantas no estado fenológico de três folhas ou 7.3.2 — Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer imediatamente anterior. uma fenda em diagonal com 1,0cm de comprimento e A murchidão pode também ser induzida por popu- com uma profundidade de cerca de 2/3 do diâmetro lações de outras bactérias ou fungos presentes no se- do caule, começando a incisão a partir da gota de dimento do tecido do tubérculo. Incluem-se Ralstonia sedimento. solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora 7.3.3 — Selar o corte com vaselina esterilizada apli- e E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysan- cada com uma seringa. themi, Phoma exigua var. foveata, assim como eleva- 4084 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 das populações de bactérias saprófitas. Em particular, directamente a partir dos sedimentos ressuspensos dos Erwinia chrysanthemi pode provocar sintomas nas tecidos dos tubérculos ou plantas de batateira (n.º 3.1.6 folhas e murchidão que se assemelham bastante aos ou n.º 3.2.5). O isolamento directo de C. m. subsp. sintomas provocados por C. m. subsp. sepedonicus. A sepedonicus pode, contudo, ser possível com um meio única diferença é o escurecimento dos caules no caso selectivo e uma diluição adequada do sedimento res- das infecções por Erwinia chrysanthemi. Outras mur- suspenso dos hilos ou dos caules de batateiras. chidões podem distinguir-se da causada C. m. subsp. Devem ser efectuados isolamentos de todos os tu- sepedonicus porque as folhas inteiras, ou a planta in- bérculos ou segmentos de caule de batateira que apre- teira, murcham rapidamente. Pode também realizar-se sentem sintomas típicos, bem como de beringelas ino- uma coloração de Gram: este teste diferenciará a C. culadas que, muito embora possam não ter manifestado m. subsp. sepedonicus de Erwinia spp. sintomas, se revelem positivas no teste IF/PCR reali- 7.9 — Logo que se observem sintomas nas beringe- zado sobre amostras compostas (ver n.º 7.10). A ma- las, deverá efectuar-se o re-isolamento, utilizando-se ceração dos caules de beringela, quando necessária, secções de tecido foliar exibindo murchidão ou do deve ser efectuada tal como descrito no n.º 3.2.2. caule das plantas (ver n.º 3.2.2, para a maceração do Como controlos positivos, preparar diluições deci- tecido). Desinfectar a superfície das folhas e caules das mais de uma suspensão de 106 ufc por ml de C. m. beringelas passando-os por etanol a 70 %. Efectuar um subsp. sepedonicus (por exemplo, NCPPB 4053 ou teste IF ou PCR da seiva da beringela e isolar em PD 406). Para evitar qualquer possibilidade de conta- meios (selectivos) adequados (ver n.º 8). Pode também minação, os controlos positivos devem ser preparados ser realizada uma coloração de Gram (apêndice n.º 9). totalmente à parte das amostras a testar. Identificar culturas puras de presumíveis isolados de A boa qualidade de cada novo lote de meio selec- C. m. subsp. sepedonicus e confirmar a sua patogeni- tivo para o crescimento do patogéneo deve ser testada cidade (ver n.os 9 e 10). antes da sua utilização para análise de amostras de 7.10 — Em certas circunstâncias, especialmente rotina. quando as condições de cultivo não são as óptimas, é Testar o material de controlo de forma idêntica à possível que C. m. subsp. sepedonicus esteja presente da(s) amostra(s). nas beringelas embora sob a forma de infecção laten- 8.1 — Diluição em placas com meio selectivo: te, mesmo depois de períodos de incubação de até 4 8.1.1 — A partir de uma alíquota de 100μl de uma semanas. Caso não se observem sintomas após 4 se- amostra de sedimento ressuspenso de batateira ou de manas, efectuar o teste IF ou PCR numa amostra com- seiva de beringela, efectuar diluições decimais em tam- posta de secções do caule com 1 cm de cada uma das pão de ressuspensão (apêndice n.º 3). plantas inoculadas, colhidas acima do local da inocu- 8.1.2 — O isolamento a partir de sedimento ressus- lação. Se os resultados do teste forem positivos, deve- penso de batateira não diluído é frequentemente infru- rá efectuar-se o re-isolamento em meios adequados tífero em consequência da lentidão do crescimento de (selectivos), de acordo com o procedimento referido C. m. subsp. sepedonicus e da competição de organis- no n.º 8. Identificar culturas puras de presumíveis iso- mos saprófitas. Contudo, visto que as populações da lados de C. m. subsp. sepedonicuss e confirmar a sua bactéria presentes nos tecidos infectados são habitual- patogenicidade (n.os 9 e 10). mente elevadas, os organismos saprófitas podem ge- Interpretação do resultado do bioensaio: ralmente ser eliminados por diluição, enquanto que o Obtêm-se resultados válidos no bioensaio quando as patogéneo permanece. Assim, recomenda-se o espalha- plantas do controlo positivo revelam sintomas típicos, mento de 100μl de cada uma das amostras em estudo, é possível isolar a bactéria a partir destas plantas e não diluições 1/100 a 1/10000, nos meios MTNA ou NCP- se observam sintomas nos controlos negativos. -88 (apêndice n.º 5) (caso se utilizem placas de Petri O bioensaio é negativo se as plantas inoculadas com de 90mm de diâmetro; para outros diâmetros de pla- os extractos das amostras não estiverem infectadas por ca, ajustar o volume), com recurso a varetas em l e à C. m. subsp. sepedonicus e se se detectar C. m. subsp. técnica de diluição em placa. sepedonicus nos controlos positivos. O bioensaio é positivo se as plantas inoculadas com Nota. — Uma estratégia alternativa consiste em es- os extractos das amostras estiverem infectadas por palhar os 100μl de alíquota inicial de sedimento res- C. m. subsp. sepedonicus. suspenso de batateira numa primeira placa com uma 8 — Isolamento de C. m. subsp. sepedonicus: vareta em L, utilizar a mesma vareta para espalhar numa segunda placa qualquer resíduo que tenha fica- Nota. — O diagnóstico apenas está completo se se do na vareta e, por fim, repetir este procedimento para isolar C. m. subsp. sepedonicus, se esta bactéria for uma terceira placa, conseguindo-se assim um efeito de subsequentemente identificada (ver n.º 9) e confirma- diluição em placas através da vareta. da a sua identificação por um teste de patogenicidade (n.º 10). Embora C. m. subsp. sepedonicus seja um 8.1.3 — Incubar as placas, no escuro, a uma tem- organismo difícil de cultivar, pode ser isolado a partir peratura compreendida entre 21 e 23°C. de tecidos sintomáticos. 8.1.4 — No decurso das observações iniciais das placas, e tendo como referência as placas de controlo No entanto, como as bactérias saprófitas podem positivo, procede-se à contagem de colónias semelhan- crescer mais rapidamente, é difícil isolar o patogéneo tes às de C. m. subsp. sepedonicus. Estas observações Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4085 efectuam-se ao fim de 3 dias, realizando-se novas con- utilizando inóculos a partir de subculturas em agar tagens após 5, 7 e, eventualmente, 10 dias. nutritivo. As comparações morfológicas devem ser fei- 8.2 — Purificação de colónias suspeitas: tas em culturas em agar nutritivo com dextrose. Nota. — A subcultura de colónias semelhantes a Testes Resultado esperado C. m. subsp. sepedonicus deve ser efectuada em meio YGM para posterior inoculação em beringelas e/ou Teste de oxidação/fermentação (O/F) Inerte ou fracamente subsequente identificação; este processo deve realizar- oxidativa -se antes que o crescimento bacteriano seja demasia- Produção de oxidase – do, ou seja, ao fim de 3-5 dias. Crescimento a 37°C – Produção de urease – 8.2.1 — Fazer um reticulado a partir das colónias Hidrólise da esculina + com uma morfologia semelhante à de C. m. subsp. Hidrólise do amido – ou fraca sepedonicus num dos seguintes meios (as suas com- Tolerância a NaCl a 7% – posições são apresentadas no apêndice n.º 5): Produção de indole – Agar nutritivo com dextrose (só para utilização em Produção de catalase + subcultura); Produção de H2S – Agar com peptona, levedura e glucose; Agar com extracto de levedura e sais minerais. Utilização de citrato – Liquefacção da gelatina – Incubar a uma temperatura compreendida entre 21 Produção de ácido a partir de glicerol – e 24°C durante, no máximo, 10 dias. Produção de ácido a partir de lactose – ou fraca C. m. subsp. sepedonicus cresce lentamente e, após Produção de ácido a partir de ramnose – 10 dias de incubação, produz normalmente colónias Produção de ácido a partir de salicina – pontiformes, cremes e convexas (ver imagens de co- lónias típicas de C. m. subsp. sepedonicus no sítio web Coloração de Gram (apêndice n.º 9) + http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). 8.2.2 — Voltar a fazer um reticulado para confirmar 9.2 — Teste IF: a pureza do isolado. As taxas de crescimento melhoram com uma sub- a) Preparar uma suspensão com cerca de 106 célu- cultura. As colónias típicas são creme-esbranquiçadas las por ml em tampão IF (apêndice n.º 3); ou cor de marfim, ocasionalmente amarelas, arredon- b) Preparar uma série de diluições a 1/2 de um anti- dadas, lisas, convexas, com um aspecto mucóide-flui- -soro adequado; do, com margens inteiras e, normalmente, com 1 a c) Aplicar o procedimento de IF (n.º 4); 3mm de diâmetro. d) Um resultado positivo no teste IF é alcançado se Uma simples coloração de Gram (apêndice n.º 9) o título IF da cultura for equivalente ao do controlo pode ajudar a seleccionar as colónias a submeter a positivo. outros testes. 8.2.3 — Identificar culturas de presumíveis isolados 9.3 — Teste PCR: C. m. subsp. sepedonicus (ver n.º 9) e efectuar um teste de patogenicidade (ver n.º 10). a) Preparar uma suspensão com cerca de 106 célu- 9 — Identificação: las por ml em água ultra pura (UPW); Identificar culturas puras de presumíveis isolados de b) Aquecer 100μl da suspensão de células em tu- C. m. subsp. sepedonicus, utilizando, pelo menos, dois bos fechados num bloco de aquecimento ou em ba- dos seguintes testes baseados em princípios biológicos nho-maria a 100°C durante 4 minutos. Se necessário, diferentes. a adição de hidróxido de sódio recentemente prepara- Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que do com uma concentração final de 0,05M pode auxi- adequado, para cada teste realizado. liar a lise das células. As amostras podem, então, ser 9.1.— Testes nutricionais e enzimáticos de identifi- armazenadas a uma temperatura compreendida entre cação: –16 e –24°C até serem necessárias; Determinar as seguintes características fenotípicas c) Aplicar os procedimentos da PCR adequados para que estão universalmente presentes ou ausentes em C. assim se obterem os fragmentos amplificados especí- m. subsp. sepedonicus, de acordo com os métodos ficos de C. m. subsp. sepedonicus (por exemplo, Pas- descritos por Anónimo (1987), Klement et al. (1990), Lelliott e Stead (1987) e Schaad (2001). trick, 2000, ver apêndice n.º 6 ou ainda Li e de Boer, Todos os meios devem ser incubados a 21°C e exa- 1995; Mills et al., 1997; Pastrik e Rainey, 1999; Scha- minados ao fim de seis dias. Se não houver crescimen- ad et al., 1999); to, incubar, no máximo, 20 dias. d) É alcançada uma identificação positiva de C. m. Todos os testes devem incluir um controlo com uma subsp. sepedonicus se os fragmentos amplificados pela estirpe conhecida de C. m. subsp. sepedonicus. Todos PCR tiverem o mesmo tamanho e padrão de restrição os testes nutricionais e fisiológicos têm de ser feitos que a estirpe de controlo positivo. 4086 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 9.4 — Teste FISH: subsp. sepedonicus e para avaliar a virulência dos a) Preparar uma suspensão com cerca de 106 célu- isolados identificados como C. m. subsp. sepedoni- las por ml em UPW; cus: b) Aplicar o procedimento FISH (n.º 5); 10.1 — Preparar um inóculo de aproximadamente c) Um resultado positivo no teste FISH é alcança- 106 células por ml de culturas com 3 dias do isolado do se isolado em estudo apresentar as mesmas reac- em estudo e de uma estirpe de C. m. subsp. sepedoni- ções do controlo positivo. cus adequada para controlo positivo. 10.2 — Inocular 5-10 caules de beringelas proveni- 9.5 — Perfis de ácidos gordos (FAP): entes de plântulas no estado fenológico de 3 folhas a) Incubar o isolado em agar de soja e tripticase verdadeiras (n.os 7.3 ou 7.4). (Oxoid) durante 72 horas a 21 C (+/–1°C); 10.3 — Incubar a uma temperatura compreendida b) Utilizar um procedimento FAP adequado (Janse, entre 18 e 24°C com luz suficiente e uma humidade 1991; Stead, 1992); relativa elevada, regando adequadamente para evitar o c) Um resultado positivo no teste FAP é alcançado alagamento ou a seca (n.º 7.7). Com culturas puras se o perfil do isolado em estudo for idêntico ao do deve observar-se a murchidão típica no período de 2 controlo positivo. A presença de ácidos gordos carac- semanas, mas as plantas que não apresentem sintomas terísticos 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 (ver n.º 7.8) ao fim desse período, devem ser incuba- Iso, 16:0 e 17:0 Anteiso é altamente indicativa de das até à 3.ª semana, a uma temperatura que favoreça C. m. subsp. sepedonicus. Outros géneros como Cur- o crescimento da beringela, mas não devendo exceder tobacterium, Arthrobacter e Micrococcus também têm os 25°C (apêndice n.º 8). Se ao fim de 3 semanas não alguns destes ácidos mas o 15:1 Anteiso A é um áci- se observarem quaisquer sintomas, não se pode con- do raro nestas bactérias que ocorre, no entanto, em firmar que o isolado seja uma forma patogénica de Clavibacter spp. com um valor entre 1 e 5 %. Para C. m. subsp. sepedonicus o valor é, normalmente, de C. m. subsp. sepedonicus. cerca de 5 %. 10.4 — Efectuar um isolamento a partir das plantas com sintomas, retirando-lhes uma n.º de 2cm de caule 9.6 — BOX-PCR: acima do ponto de inoculação. Fragmentá-las e suspendê-las num pequeno volume de água destilada a) Preparar uma suspensão com cerca de 106 célu- esterilizada ou de tampão fosfato 50mM (apêndice las por ml em UPW; b) Aplicar o teste de acordo com o procedimento n.º 3). Isolar a partir de diluições apropriadas da sus- descrito por Smith et al., (2001). pensão por espalhamento ou reticulado em MTNA e YPGA (apêndice n.º 5), incubar durante 3-5 dias a uma 10 — Teste de confirmação: temperatura compreendida entre 21 e 23°C e observar O teste de patogenicidade tem de ser efectuado a formação de colónias típicas de C. m. subsp. sepe- como confirmação final do diagnóstico de C. m. donicus. APÊNDICE N.º 1 Laboratório (1) Localização País Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Viena e Linz Áustria Departement Gewasbescherming Merelbeke Bélgica Plantedirektoratet Lyngby Dinamarca Central Science Laboratory York Inglaterra Scottish Agricultural Science Agency Edimburgo Escócia Laboratoire National de la Protection des Végétaux - Unité de Bactériologie Angers França Laboratoire National de la Protection des Végétaux - Station de Quarantaine de la Le Rheu França Pomme de Terre Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Alemanha Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Alemanha State Laboratory Dublin Irlanda Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Países Baixos Norwegian Crop Research Institute, Plant Protection Centre Aas Noruega Direcção-Geral de Protecção das Culturas (DGPC) Lisboa Portugal Nacionalni Institut za Biologijo Liubliana Eslovénia Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Espanha (1) Cientistas de contacto: ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4087 APÊNDICE N.º 2 Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- Preparação de controlos positivos e negativos zar em autoclave a 121°C durante 15 minutos. para os testes essenciais de rastreio PCR/IF e FISH Os seguintes componentes adicionais podem também ser úteis: Preparar uma suspensão a partir do crescimento em meio basal MTNA de uma cultura com 72 horas de Quantidade (por Finalidade uma estirpe virulenta de C. m. subsp. sepedonicus l) (NCPPB 4053 ou PD 406), em tampão fosfato 10mM, Flocos de Lubrol Antifloculante (*) 0,5g por forma a obter uma concentração de, aproximada- Antiespuma DC silicone Antiespumante (*) 1,0ml mente, 1 a 2 × 108ufc por ml. Esta é obtida, normal- Pirofosfato tetrassódico Antioxidante 1,0g mente, com uma suspensão ligeiramente turva, equi- valente a uma densidade óptica de 0,20 a 600nm. Polivinilpirrolidona- Complexante de 50g 40000 (PVP-40) inibidores da PCR Remover os cones dos hilos de 200 tubérculos co- lhidos de uma variedade de epiderme branca isenta de (*) Para utilização com o método de extracção por homogeneização. C. m. subsp. sepedonicus. Processar os hilos como habitualmente e ressuspen- 1.2 — Tampão de ressuspensão (tampão fosfato der o sedimento em 10ml. 10mM, pH 7,2): Preparar 10 microtubos esterilizados de 1,5 ml com Este tampão é utilizado para a ressuspensão e di- 900μl de sedimento ressuspenso. Transferir 100μl da suspensão de C. m. subsp. se- luição dos extractos dos cones dos hilos dos tubércu- pedonicus para o primeiro microtubo. Agitar em vor- los de batateira, após a sua concentração por centrifu- tex. gação. Utilizar os cinco microtubos seguintes para efectuar uma série de cinco diluições decimais. Na2HPO4.12H2O — 2,7g Os seis microtubos assim contaminados são utiliza- NaH2PO4.2H2O — 0,4g dos como controlos positivos. Os quatro microtubos Água destilada — 1,00 l não contaminados são utilizados como controlos ne- gativos. Rotular os microtubos em conformidade. Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- Preparar alíquotas de 100μl em microtubos esterili- zar em autoclave a 121°C durante 15 minutos. zados de 1,5ml, obtendo assim nove réplicas de cada 2 — Tampões para o teste IF: amostra de controlo. Armazenar a uma temperatura 2.1 — Tampão IF (tampão fosfato salino (PBS) compreendida entre –16 e –24°C até à sua utilização. 10mM, pH 7,2): A presença e a quantificação de C. m. subsp. sepe- donicus nas amostras de controlo devem ser primeiro Este tampão é utilizado para a diluição dos anticor- confirmadas por IF. pos e segundo passo da lavagem das lâminas. Para o teste PCR, efectuar a extracção de ADN das amostras de controlo positivo e negativo para cada Na2HPO4.12H2O — 2,7g série de amostras a testar. NaH2PO4.2H2O — 0,4g Para os testes IF e FISH efectuar ensaios nas amos- NaCl — 8,0g tras de controlo positivas e negativas para cada série Água destilada — 1,0 l de amostras a testar. Para os testes IF, FISH e PCR, devem detectar-se Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- C. m. subsp. sepedonicus, pelo menos, nas amostras zar em autoclave a 121°C durante 15 minutos. de controlo positivo com 106 e 104 células por ml e 2.2 — Tampão IF-Tween: esta bactéria não deve ser detectada em nenhum con- Este tampão é utilizado no primeiro passo da lava- trolo negativo. gem das lâminas. APÊNDICE N.º 3 Adicionar 0,1% de Tween 20 ao tampão IF. Tampões para a realização dos testes 2.3 — Tampão fosfato com glicerol, pH 7,6: Este tampão é utilizado como fluido de montagem Geral: nos poços das lâminas de IF para aumentar a fluores- Os tampões esterilizados não abertos podem ser cência. armazenados durante 1 ano. 1 — Tampões para extracção: Na2HPO4.12H2O — 3,2g 1.1 — Tampão de extracção (tampão fosfato 50mM, NaH2PO4.2H2O — 0,15g pH 7,0): Este tampão é utilizado para a extracção da bacté- Glicerol — 50ml ria dos tecidos vegetais por homogeneização ou agita- Água destilada — 100 ml ção. Estão comercialmente disponíveis soluções de mon- Na2HPO4 (anidro) — 4,26g tagem para evitar a rápida perda de fluorescência como KH2PO4 — 2,72g sejam, por exemplo, Vectashield® (Vector Laborato- Água destilada — 1,00 l ries) ou Citifluor® (Leica). 4088 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 APÊNDICE N.º 4 Extracto de levedura e sais minerais (YGM) Determinação do nível de contaminação nos testes IF e FISH Bacto extracto de levedura (Difco) — 2,0g D(+)glucose mono-hidratada — 2,5g 1 — Determinar o número médio de células fluores- K 2HPO4 — 0,25g centes típicas por campo de observação (c). KH2PO4 — 0,25g 2 — Calcular o número de células fluorescentes tí- MgSO4.7H2O — 0,1 g picas por poço de lâmina de microscópio (C): MnSO4.H2O — 0,015g NaCl — 0,05g C = c x S/s FeSO4.7H2O — 0,005g Em que: Bacto-Agar (Difco) — 18,0g S = área da superfície de cada poço da lâmina de Água destilada — 1,0 l poços múltiplos, e s = área da superfície do campo da objectiva Dissolver os ingredientes e esterilizar volumes de meio litro em autoclave a 115°C durante 20 minutos. s = ði2/4G2K2 b) Meios de crescimento selectivo validados: Em que: i = coeficiente de campo (varia entre 8 e 24, de- Meio MTNA pendendo do tipo de ocular) Excepto quando assinalado em contrário, todos os K = coeficiente do tubo (1 ou 1,25) componentes do meio são da BDH G = ampliação da objectiva (l00x, 40x, etc.) Extracto de levedura (Difco) — 2,0g Manitol — 2,5g 3 — Calcular o número de células fluorescentes tí- K 2HPO4 — 0,25g picas por ml de sedimento ressuspenso (N). KH2PO4 — 0,25g NaCl — 0,05g N = C x 1000/y x F MgSO4.7H2O — 0,1g MnSO4.H2O — 0,015g Em que: FeSO4.7H2O — 0,005g y = volume de sedimento ressuspenso em cada poço, Agar (Oxoid n.º 1) — 16,0g e Água destilada — 1,0 l F = factor de diluição do sedimento ressuspenso Dissolver os ingredientes e ajustar o pH a 7,2. Após autoclavagem (a 121°C durante 15 minutos) e arrefe- APÊNDICE N.º 5 cimento a 50°C, adicionar os antibióticos: trimetopri- Meios de isolamento e cultura de C. m. subsp. ma 0,06g, ácido nalidíxico 0,002g e anfotericina sepedonicus B 0,01g. Soluções concentradas de antibiótico: trimetoprima a) Meios gerais de crescimento: (Sigma) e ácido nalidíxico (Sigma) (ambos a 5mg/ml), Agar nutritivo (NA) em metanol a 96% e anfotericina B (Sigma) (1mg/ml) em dimetilsulfóxido. As soluções concentradas são Agar nutritivo (Difco) — 23,0g esterilizadas por filtração. Água destilada — 1,0 l Nota. — A durabilidade do meio basal é de 3 me- Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave ses. Após a adição dos antibióticos, a durabilidade é a 121°C durante 15 minutos. de 1 mês quando armazenado refrigerado. Agar nutritivo com dextrose (NDA) Meio NCP-88 Bacto-Agar nutritivo da Difco com 1% de Agar nutritivo (Difco) — 23,0g D(+)glucose mono-hidratada. Esterilizar em autoclave Extracto de levedura (Difco) — 2,0g a 115°C durante 20 minutos D-manitol — 5,0 g K 2HPO4 — 2,0g Agar com extracto de levedura, peptona e glucose KH2PO4 — 0,5g (YPGA) MgSO4.7H2O — 0,25g Extracto de levedura (Difco) — 5,0 g Bacto-Peptona (Difco) — 5,0g Dissolver os ingredientes e ajustar o pH a 7,2. Após D(+)glucose mono-hidratada — 10,0g autoclavagem e arrefecimento a 50°C, adicionar os Bacto-Agar (Difco) — 15,0g seguintes antibióticos: sulfato de polimixina B (Sigma) Água destilada — 1,0 l 0,003g, ácido nalidíxico (Sigma) 0,008g e ciclohexi- mida (Sigma) 0,2g. Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave Dissolver os antibióticos em soluções concentradas a 121°C durante 15 minutos. da seguinte forma: ácido nalidíxico em NaOH 0,01M, Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4089 cicloheximida em etanol a 50 % e sulfato de polimi- 1.3 — Condições de reacção da PCR: xina B em água destilada. As soluções concentradas Correr o seguinte programa: são esterilizadas por filtração. 1 ciclo de: Nota. — A durabilidade do meio basal é de 3 me- i) 3 minutos a uma temperatura de 95°C (desnatu- ses. Após a adição dos antibióticos, a durabilidade é ração do ADN- alvo). de 1 mês quando armazenado refrigerado. 10 ciclos de: ii) 1 minuto a uma temperatura de 95°C (desnatu- ração do ADN-alvo); APÊNDICE N.º 6 iii) 1 minuto a uma temperatura de 64°C (empare- Protocolo e reagentes da PCR validados lhamento dos iniciadores); iv) 1 minuto a uma temperatura de 72°C (extensão Nota. — O teste preliminar deve permitir a detec- da cópia). ção reprodutível de, pelo menos, 103 a 104 células de C. m. subsp. sepedonicus por ml de amostra de ex- 25 ciclos de: tractos. O teste preliminar não deve ainda revelar nenhum v) 30 segundos a uma temperatura de 95°C (desna- resultado falso positivo com um painel de estirpes turação do ADN-alvo); bacterianas seleccionadas. vi) 30 segundos a uma temperatura de 62°C (empa- relhamento dos iniciadores); 1 — Protocolo PCR Multiplex com controlo inter- vii) 1 minuto a uma temperatura de 72°C (extensão no da PCR (Pastrik, 2000): da cópia); 1.1 — Iniciadores: Iniciador directo PSA-1 — 5’- ctc ctt gtg ggg tgg 1 ciclo de: gaa aa -3’ viii) 5 minutos a uma temperatura de 72°C (exten- Iniciador inverso PSA-R — 5’- tac tga gat gtt tca são final); ctt ccc c -3’ ix) Manter a uma temperatura de 4°C. Iniciador directo NS-7-F — 5’- gag gca ata aca ggt ctg tga tgc -3’ Nota. — Este programa está optimizado para utili- Iniciador inverso NS-8-R — 5’- tcc gca ggt tca cct zação com um termociclador MJ Research PTC 200. acg ga -3’ Para a utilização com outros modelos pode ser neces- sária a alteração da duração das fases dos ciclos ii), Tamanho esperado do fragmento amplificado do iii), iv), v), vi) e vii). ADN-alvo de C. m. subsp. sepedonicus = 502bp (con- junto iniciador PSA). 1.4 — Análise de restrição enzimática do fragmen- Tamanho esperado do fragmento amplificado do to amplificado: controlo interno da PCR de 18S rRNA = 377bp (con- Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN junto iniciador NS). de C. m. subsp. sepedonicus produzem um polimor- fismo do comprimento do fragmento de restrição ca- 1.2 —Mistura de reacção da PCR: racterístico com a enzima Bgl II após incubação a uma temperatura de 37 C durante 30 minutos. Os fragmen- Volume por Concentração Reagentes reacção final tos de restrição obtidos de um fragmento específico de C. m. subsp. sepedonicus possuem tamanhos de 282bp UPW esterilizada 15,725 μl 1 e 220bp. Tampão PCR ( ) 10x (MgCl2 1x (MgCl2 2 — Preparação do tampão de carregamento: 2,5 μl 15mM) (2) 1,5mM) 2.1 — Azul de bromofenol (solução concentrada a BSA (fracção V) (10%) 0,25 μl 0,1 % 10 %): Mistura d-NTP (20mM) 0,125 μl 0,1 mM Azul de bromofenol — 5 g Iniciador PSA-1 (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM Água destilada (bidest) — 50 ml Iniciador PSA-R (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM Iniciador NS-7-F (10 μM) (2) 0,1 μl 0,04 μM 2.2 — Tampão de carregamento: Iniciador NS-8-R (10 μM) (2) 0,1 μl 0,04 μM Glicerol (86%) — 3,5 ml Taq polimerase (5U/μl) (1) 0,2 μl 1,0 U Azul de bromofenol — 300 μl Volume da amostra 0,5 μl Água destilada (bidest) — 6,2 ml Volume total: 25,0 μl (1) Os métodos foram validados utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer 3 — Tampão de tris acetato EDTA (TAE) 10X, (AmpliTaq ou Gold) e Gibco BRL. pH 8,0: (2) A concentração de iniciadores NS-7-F e NS-8-R foi optimizada para a extracção da bactéria a partir dos cones dos hilos dos tubérculos de batateira, Tampão tris — 48,4 g utilizando o método de homogeneização bem como o de purificação do ADN de Ácido acético glacial — 11,42 ml acordo com Pastrik (2000) (ver alínea a) do n.º 6.1 e o n.º 6.2). Será necessária a re-optimização das concentrações do reagente se se utilizar a extracção por EDTA (sal dissódico) — 3,72 g agitação ou outros métodos de isolamento do ADN. Água destilada — 1,00 l 4090 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 Diluir até 1x antes de utilizar. Quantidades sugeridas para a preparação da solução de hibridação Também disponível comercialmente (por exemplo, Invitrogen ou equivalente). 2 lâminas 8 lâminas APÊNDICE N.º 7 UPW esterilizada 50,1 200,4 «Hybmix» 3X 30,0 120,0 Reagentes validados para o teste FISH SDS 1% 0,9 3,6 1 — Sondas: Sonda EUB 338 (100 ng/ȝl) 4,5 18,0 Sonda específica para C. m. subsp. sepedonicus CMS- Sonda CMSCY301 (100 ng/ȝl) 4,5 18,0 -CY3-01 — 5’- ttg cgg ggc gca cat ctc tgc acg -3’ Volume total (ȝl) 90,0 360,0 Sonda para eubactérias não específica EUB-338- -FITC — 5’- gct gcc tcc cgt agg agt -3’ Nota. — Armazenar todas as soluções contendo son- 2 — Solução fixadora: das fotossensíveis, no escuro, a uma temperatura de –20°C. Proteger da exposição directa à luz solar ou Nota. — Atenção! O fixador contém paraformaldeí- eléctrica durante a utilização. do, um produto tóxico. Utilizar luvas e não inalar. É 5 — Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0: aconselhável trabalhar em «hotte». Na2HPO4 — 8,52 g i) Aquecer 9 ml de água de grau molecular [por KH2PO4 — 5,44 g exemplo, água ultra pura (UPW)] a cerca de 60°C e Água destilada — 1,00 l adicionar 0,4g de paraformaldeído. O paraformaldeí- do dissolve-se após a adição de 5 gotas de NaOH 1N Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- e a agitação num agitador magnético; zar em autoclave a 121°C durante 15 minutos. ii) Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1ml de tampão fosfato 0,1M (PB; pH 7,0) e 5 gotas de APÊNDICE N.º 8 HCl 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajus- tar, se necessário, com HCl ou NaOH. Condições de cultivo de beringela Semear beringelas (Solanum melongena) em tabu- Nota. — Atenção! Não utilizar um medidor de pH leiros com substrato pasteurizado apropriado. O trans- em soluções contendo paraformaldeído. plante das plântulas faz-se quando os cotilédones es- tão completamente expandidos (10 a 14 dias) para iii) Filtrar a solução através de um filtro de mem- vasos com substrato para cultura igualmente pasteuri- brana de 0,22μm e manter ao abrigo da poeira a 4°C zado. até à sua utilização. As beringelas devem ser cultivadas em estufa, nas iv) Nota: seguintes condições ambientais: Solução fixadora alternativa: etanol a 96%. Fotoperíodo 14 horas ou duração do dia natural se esta for superior; 3 — «Hybmix» 3X: Temperatura diurna 21 a 24°C; NaCl — 2,7M nocturna 15°C. Tris-HCl — 60mM (pH 7,4) EDTA esterilizado por filtração e autoclavado — Variedades de «Black Beauty»; 15mM beringela susceptíveis: «Long Tom»; «Rima»; Diluir até 1x, conforme necessário. «Balsas». 4 — Solução de hibridação: «Hybmix» 1X: Fornecedor: ver sítio web http://forum.europa.eu.int/ Public/irc/sanco/Home/main. Dodecilsulfato de sódio (SDS) — 0,01 % Sonda EUB 338 — 5 ng/ìl Sonda CMSCY301 — 5 ng/ìl APÊNDICE N.º 9 Coloração de Gram (modificação de Hucker) Preparar quantidades de solução de hibridação, de (Doetsch, 1981) (*) acordo com os cálculos apresentados seguidamente. Para cada lâmina (contendo 2 amostras diferentes em Solução de violeta de cristal: duplicado) são necessários 90ìl de solução de hibri- Dissolver 2 g de violeta de cristal em 20 ml de eta- dação. nol a 95 %. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4091 Dissolver 0,8 g de oxalato de amónio em 80 ml de 4 — Doetsch, R. N., 1981. Determinative methods água destilada. of light microscopy. Em: Manual of methods for ge- neral bacteriology, American Society for Microbiolo- Misturar as duas soluções. gy, Washington, 21-23. 5 — Hugh, R. e Leifson, F., 1953. The taxonomic Solução de Lugol: significance of fermentative versus oxidative metabo- lism of carbohydrates by various gram-negative bacte- Iodo — 1 g ria. J. Bact., 66, 24-26. Iodeto de potássio — 2 g 6 — Janse, J. D., 1991. Infra- and intra-specific clas- Água destilada — 300 ml sification of Pseudomonas solanacearum strains using whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied Triturar num almofariz o iodo e o iodeto de potás- Microbiology 14; 335-345. sio. Adicionar à água e agitar num recipiente fechado 7 — Janse, J. D. e J. Van Vaerenbergh. The inter- até dissolução. pretation of the EC method for the detection of latent ring rot infections (Corynebacterium sepedonicum) in Solução de safranina para contraste: potato. EPPO Bol., N.o 17, 1987, pp. 1-10. Solução concentrada: 8 — Jansing, H. e K. Rudolph, 1998. Physiological Safranina O — 2,5 g capabilities of Clavibacter michiganensis ssp. sepedo- Etanol a 95 % — 100 ml nicus and development of a semi-selective medium. Journal of Plant Diseases and Protection, 105, 590-601. Misturar e guardar. 9 — Kovacs, N., 1956. Identification of Pseudomo- Diluir 1:10 para obter uma solução de trabalho. nas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature, Lond., 178, 703. Procedimento de coloração: 10 — Klement Z.; Rudolph, K e D. C. Sands, 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kiadó, Bu- 1) Preparar esfregaços em lâminas de vidro, secá- dapest, 568 pp. -los ao ar e fixá-los pelo calor; 11 — Lelliott, R. A., 1966. The plant pathogenic 2) Cobrir a lâmina com solução de violeta de cris- coryneform bacteria. J. appl. Bact., 29, 114-118. tal durante um minuto; 12 — Lelliott, R. A., E. Billing e A. C. Hayward, 3) Lavar rapidamente com água corrente; 1966. A determinative scheme for the fluorescent plant 4) Cobrir com solução de Lugol durante um minuto; pathogenic pseudomonads J. appl. Bact., 29, 470-489. 5) Lavar com água corrente e secar com papel ab- 13 — Lelliott, R. A. e P. W., Sellar, 1976. The de- sorvente; tection of latent ring rot (Corynebacterium sepedoni- 6) Descorar com etanol a 95 % em gotas até que cum (Spiek. et Kotth.) Skapt. et Burkh.) in potato sto- estas fiquem incolores, ou mergulhar em etanol com cks. EPPO Bol. 6 (2), 101-106. agitação suave durante 30 segundos; 14 — Li, X. e S.H. de Boer, 1995. Selection of Po- 7) Lavar em água corrente e secar com papel ab- lymerase Chain Reaction primers from RNA interge- sorvente; nic spacer region for specific detection of Clavibacter 8) Cobrir com solução de safranina durante 10 se- michiganensis ssp. sepedonicus. Phytopathology, 85, gundos; 837-842. 9) Lavar com água corrente e secar com papel ab- 15 — Mills, D., Russell, B., W. e J., W. Hanus, sorvente. 1997. Specific detection of Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus by amplification of three unique DNA Nota. — As bactérias Gram-positivas coram de azul- sequences isolated by subtraction hybridization. Phyto- -violeta e as Gram-negativas de vermelho-rosado. pathology, 87, 8, 853-861. (*) Podem também ser utilizados soluções e kits de coloração 16 — Pastrik, K. -H. e R.A. Rainey. 1999. Identifi- disponíveis no mercado. cation and differentiation of Clavibacter michiganen- sis subspecies by polymerase chain reaction-based te- chniques. J. Phytopathology 147; 687-693. Referências bibliográficas 17 — Pastrik, K.-H., 2000. Detection of Clavibac- ter michiganensis ssp. sepedonicus in potato tubers by 1 — Anónimo, 1987. Scheme of the detection and multiplex PCR with coamplification of host DNA. diagnosis of the ring rot bacterium Corynebacterium European Journal of Plant Pathology, 106, 155-165. sepedonicum in batches of potato tubers. Comissão das 18 — Ramamurthi, C. S., 1959. Comparative studi- Comunidades Europeias, Luxemburgo. Publ EUR es on some Gram-positive phytopathogenic bacteria 11288 EN, 21 pp. and their relationship to the Corynebacteria. Mem. 2 — Bradbury, J. F., 1970. Isolation and prelimina- Cornell agric. Exp. Sta., 366, 52 pp. ry study of bacteria from plants. Rev. Pl. Path., 49, 19 — Schaad, W., Berthier-Schaad, Y., Sechler, A. 213-218. e Knorr, D. (1999) Detection of Clavibacter michiga- 3 — Dinesen, I. G., 1984. The extraction and diag- nensis subsp. sepedonicus in potato tubers by BIO-PCR nosis of Corynebacterium sepedonicum from diseased and an automated real-time fluorescence detection sys- potato tubers. EPPO Bol. 14 (2), 147-152. tem. Plant Disease 83; 1095-1100. 4092 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 20 — Schaad, W. 2001. Laboratory guide for iden- ANEXO III tification of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. Determinação da extensão da contaminação provável -3. ed.; St. Paul, Minnesota:, 373 pp. e da possível dispersão do organismo prejudicial 21 — Skerman, V. B. D., 1967. A guide to the iden- 1 — Os elementos a considerar na determinação da tification of the genera of bacteria. 2nd ed., William extensão da contaminação provável, nos termos da and Wilkins Company, Baltimore. alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, incluem: 22 — Smith, N. C.; Hennesy, J; Stead, D.E., 2001. Repetetive sequence-derived PCR profiling using the 1.1 — Tubérculos ou plantas cultivadas no local de BOX-A1Ralstonia solanacearum primer for rapid iden- produção declarado contaminado, nos termos da alí- tification of plant pathogen Clavibacter michiganensis nea b) do n.º 1 do artigo 6.º; ssp. sepedonicus. European Journal of Plant Patholo- 1.2 — Local ou locais de produção com alguma gy, 107 (7), 739-748. relação de produção com os tubérculos ou plantas 23 — Sneath, P. H. A. e V. G. Collins, 1974. A stu- declarados contaminados nos termos da alínea b) do dy in test reproductibility between laboratories: report n.º 1 do artigo 6.º, incluindo aqueles que partilham of Pseudomonas working party. Antonie van Leeuwe- equipamento e instalações de produção directamente ou nhoek, 40, 481-527. através de um contratante comum; 24 — Stead, D.E. 1992. Grouping of plant patho- 1.3 — Tubérculos ou plantas produzidos no local ou genic and some other Pseudomonas spp. using cellu- locais de produção referidos no número anterior ou lar fatty-acid profiles. International Journal of Syste- presentes nesse local de produção durante o período matic Bacteriology 42; 281-295. em que os tubérculos ou plantas declarados contami- 25 — Wullings, B. A.; van Beuningen, A. R.; Jan- nados, nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, se, J. D. e A. D. L. Akkermans, 1998. Detection of se encontravam no local de produção referido no Ralstonia solanacearum, which causes brown rot of n.º 1.1; potato, by fluorescent in situ hybridization with 23s 1.4 — Instalações que manuseiem batatas proveni- rRNA-targeted probes. Appl. Environ. Microbiol. 64, entes dos locais de produção referidos nos números 4546-4554. anteriores; 1.5 — Quaisquer máquinas, veículos, recipientes, ANEXO II armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros ob- jectos, incluindo material de embalagem, que possam Ocorrência suspeita e confirmação da presença do organismo prejudicial ter estado em contacto com os tubérculos ou com as batateiras declarados contaminados ao abrigo da alí- 1 — Para cada ocorrência suspeita relativamente à nea b) do n.º 1 do artigo 6.º; qual tenha sido identificado um resultado positivo no 1.6 — Todos os tubérculos ou plantas armazenados ou nos testes de rastreio, de acordo com os métodos em, ou em contacto com, quaisquer estruturas ou ob- estabelecidos no anexo I, e na pendência da confirma- jectos constantes do número anterior, antes da limpe- ção ou refutação da presença do organismo prejudi- za e desinfecção dessas estruturas ou objectos; cial, através do método referido, deve-se proceder à 1.7 — Na sequência dos testes realizados nos ter- retenção e conservação adequada, até à conclusão das mos da alínea c) do n.º 1 do artigo 6.º, os tubérculos análises dos métodos referidos, de: ou as batateiras com uma relação clonal colateral ou 1.1 — Todos os tubérculos e, sempre que possível, ascendente com os tubérculos ou as plantas declara- todas as plantas sujeitos a amostragem; dos contaminados, nos termos da da alínea b) do n.º 1 1.2 — Qualquer extracto restante e outro material do artigo 6.º, e para os quais, embora tenham apre- preparado para o ou os testes de rastreio, por exem- sentado resultados negativos quanto à presença do plo, lâminas de imunofluorescência; e organismo prejudicial, pareça existir a probabilidade de 1.3 — Toda a documentação relevante. contaminação por via clonal, sendo que o teste de variedade pode ser efectuado no sentido de verificar a Nota. — A retenção dos tubérculos permite a reali- identidade dos tubérculos ou das batateiras contami- zação, sempre que necessária, do teste da variedade. nados e com uma relação clonal; 2 — Em caso de confirmação da presença do orga- 1.8 — Local ou locais de produção de tubérculos e nismo prejudicial, deve-se proceder à retenção e à batateiras referidos no número anterior. conservação adequada, durante pelo menos um mês após a comunicação referida no n.º 2 do artigo 6.º: 2 — Os elementos a considerar na determinação da possível dispersão, nos termos da alínea e) do n.º 1 do 2.1 — Do material referido no n.º 1; artigo 6.º, incluem: 2.2 — De uma amostra conservada de material de beringela infectado, inoculado com o extracto do tu- 2.1 — A proximidade de outros locais de produção bérculo ou da planta; e de batatas ou de outras plantas hospedeiras; 2.3 — De uma cultura isolada do referido orga- 2.2 — A produção e utilização comuns de lotes de nismo. batata de semente. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4093 3 — A comunicação a que se refere n.º 2 do arti- veis de fuga do patogéneo para o ambiente, por exem- go 6.º, contém os seguintes dados: plo, através de escorrência para terras agrícolas; ou 1.3 — Na incineração; ou 3.1 — Imediatamente após a presença do organismo 1.4 — Na transformação industrial através de entre- prejudicial ter sido confirmada por testes laboratoriais, ga directa e imediata a uma unidade de transformação com recurso aos métodos estabelecidos no anexo I, com instalações de eliminação de resíduos oficialmen- pelo menos: te aprovadas, relativamente aos quais se tenha conclu- 3.1.1 — O nome da variedade do lote de batatas; ído pela não existência de qualquer risco identificável 3.1.2 — O tipo (de consumo, de semente, etc.) e, de propagação do organismo prejudicial, e com um sempre que aplicável, a categoria da batata-semente. sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade; 3.2 — Sempre que se verificar um risco de conta- ou minação de batatas provenientes ou com destino a 1.5 — Noutras medidas, desde que se tenha conclu- qualquer outro Estado membro, a DGPC, após a con- ído que não existe qualquer risco identificável de pro- firmação da ocorrência, comunica imediatamente os pagação do organismo, sendo essas medidas, bem organismos responsáveis dos Estados membros em como a respectiva justificação, comunicadas à Comis- questão, bem como à Comissão Europeia, com a in- são Europeia e aos restantes Estados membros. formação necessária, tal como: 1.6 — Em que qualquer resíduo restante associado e com origem nos procedimentos mencionados nos 3.2.1— O nome da variedade do lote de batatas; números anteriores são eliminados através de métodos 3.2.2 — O nome e o endereço do expedidor e do aprovados oficialmente, em conformidade com o dis- destinatário; posto no anexo V. 3.2.3 — A data da entrega do lote de batatas; 3.2.4 — A dimensão do lote de batatas entregue; 2 — A utilização ou eliminação adequada dos tubér- 3.2.5 — Uma cópia do passaporte fitossanitário ou, pelo menos, o número do passaporte fitossanitário, culos ou das batateiras considerados como provavel- quando apropriado, ou sempre que adequado, o número mente contaminados, ao abrigo da alínea d) do n.º 1 de registo do produtor ou comerciante e uma cópia da do artigo 6.º, e a que se refere o n.º 2 do artigo 7.º, nota de entrega. sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRA competente, e se for caso, com a devida co- 3.3 — Para cada caso e após a conclusão de todas municação aos serviços de inspecção das outras DRA as investigações: envolvidas de forma a garantir esse controlo a todo o momento, bem como, se for caso disso, mediante apro- 3.3.1 — A data de confirmação da contaminação; vação do organismo oficial responsável do Estado 3.3.2 — Uma descrição sucinta da investigação efec- membro a que a batata se destine e no qual irá ser tuada para identificar a fonte e a possível dispersão embalada ou transformada, no que diz respeito às ins- da contaminação, incluindo o nível de amostragem talações de eliminação de resíduos a que se referem efectuado; os n.os 1.1 e 1.2, é: 3.3.3 — Informação sobre as fontes de contamina- ção identificadas ou presumidas; 2.1 — Para utilização como batata de consumo, 3.3.4 — Pormenores sobre a dimensão da contami- embalada para entrega e utilização directa, sem mu- nação declarada, incluindo o número de locais de pro- dança de embalagem num local com instalações de dução e de lotes com uma indicação da variedade e, eliminação de resíduos adequadas, sendo que as bata- caso se trate de batatas para semente, da categoria; tas destinadas à plantação apenas podem ser manuse- 3.3.5 — Pormenores relativos à demarcação da zona, adas no mesmo local, se tal for feito separadamente incluindo o número de locais de produção, não decla- ou após limpeza e desinfecção; ou rados como contaminados mas incluídos na zona; 2.2 — Para utilização como batata de consumo para 3.3.6 — Quaisquer outras informações relacionadas transformação industrial, destinada a entrega directa e com o ou os surtos confirmados que a Comissão Eu- imediata a uma unidade de transformação com insta- ropeia venha a solicitar. lações adequadas de eliminação de resíduos e um sis- tema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veí- culos de transporte; ou ANEXO IV 2.3 — Para qualquer outra utilização ou forma de Aplicação de medidas de protecção fitossanitária eliminação, desde que seja comprovado que não exis- sob controlo oficial te qualquer risco reconhecido de dispersão do orga- nismo prejudicial e sob reserva de aprovação pelos or- 1 — As medidas sob controlo oficial a que se refe- ganismos oficiais responsáveis envolvidos. re o n.º 1 do artigo 7.º, consistem: 1.1 — Na utilização para a alimentação animal após 3 — Os métodos adequados de limpeza e desinfec- tratamento térmico que garanta a impossibilidade de ção dos objectos referidos no n.º 3 do artigo 7.º, de- sobrevivência do organismo prejudicial; ou vem ser aqueles relativamente aos quais se concluiu 1.2 — Na eliminação num local adequado e oficial- que não existe qualquer risco identificável de disper- mente aprovado em que não existam riscos identificá- são do organismo prejudicial, devendo ser utilizados 4094 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária 4.1.2 — Em todos os restantes campos do local de da DRA competente. produção contaminado e sob condição que os organis- 4 — A série de medidas a aplicar pelos serviços de mos oficiais responsáveis obtenham a garantia de que inspecção fitossanitária da DRA competente na zona foi eliminado o risco de aparecimento de batateiras demarcada, estabelecida nos termos da alínea e) do espontâneas e de outras plantas hospedeiras naturais n.º 1 do artigo 6.º, e a que se refere o n.º 4 do arti- do organismo prejudicial: go 7.º, inclui as seguintes acções: a) No ano de cultura seguinte ao da declaração de 4.1 — Nos locais de produção declarados contami- contaminação não são plantados tubérculos, plantas ou nados nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º: sementes verdadeiras de batateira nem qualquer outra 4.1.1 — Num campo declarado contaminado nos planta que possa constituir um hospedeiro natural do termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, quer: organismo prejudicial, podendo ser plantadas batatas a) Durante, pelo menos, os três anos de cultura de semente certificadas, apenas para a produção de seguintes ao da declaração de contaminação: batata de consumo; b) No segundo ano de cultura seguinte ao da de- i) Adopção de medidas destinadas a eliminar as claração de contaminação só são plantadas, para ob- batateiras espontâneas e outras plantas hospedeiras tenção de semente ou de batata para consumo, batatas naturais do organismo prejudicial; e de semente certificadas ou oficialmente testadas para ii) Proibição de plantar tubérculos, plantas ou se- determinar a ausência da podridão anelar e cultivadas mentes verdadeiras de batateira, ou outras plantas que sob controlo oficial em locais de produção, à excep- possam ser um hospedeiro natural do organismo pre- ção daqueles a que se refere o n.º 4.1.1; judicial, ou culturas relativamente às quais exista um c) Pelo menos durante o terceiro ano de cultivo risco identificado de dispersão do organismo prejudi- após a declaração de contaminação, só são plantadas, cial; para obtenção de semente ou de batata para consu- iii) Na primeira época de colheita de batata subse- mo, batatas de semente certificadas ou cultivadas sob quente ao período especificado na subalínea anterior, controlo oficial, a partir de batatas de semente certi- e sob condição de o campo ter sido considerado livre ficadas; de batateiras espontâneas e de outras plantas hospe- d) Em cada um dos anos de cultivo referidos nas deiras naturais do organismo prejudicial durante ins- alíneas anteriores, são tomadas medidas para eliminar pecções oficiais, pelo menos, nos dois anos de cultura batateiras espontâneas e outras plantas hospedeiras consecutivos antes da plantação, apenas é permitida a naturais do organismo prejudicial, caso surjam, e são produção de batata de consumo e os tubérculos colhi- efectuados testes oficiais às batatas colhidas em cada dos devem ser testados em conformidade com o pro- cedimento referido no anexo I; campo, em conformidade com o procedimento cons- iv) No período de colheita de batata seguinte ao tante do anexo I; referido na subalínea anterior e após um ciclo de ro- tação adequado, que é de no mínimo dois anos caso 4.1.3 — Imediatamente após a declaração de conta- se cultivem batatas, podem ser plantadas batatas, tan- minação, nos termos da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, to para a produção de batata de semente como de e após o primeiro ano de cultura seguinte, toda a batata de consumo, e é efectuada uma prospecção ofi- maquinaria e instalações de armazenamento existentes cial nos termos do artigo 3.º no local de produção e ligadas à produção de batata são limpas e desinfectadas, de modo adequado utili- b) Durante os quatro anos de cultura seguintes ao zando métodos apropriados, nos termos do n.º 3; da declaração de contaminação: 4.1.4 — Numa unidade de produção de culturas pro- tegidas em que seja possível a substituição completa i) Adopção de medidas destinadas a eliminar as do meio de cultura: batateiras espontâneas e outras plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, e a) Não são plantados tubérculos, plantas ou semen- ii) Colocação e manutenção do campo em pousio tes verdadeiras de batateira, a não ser que a unidade ou em pastagem permanente com pastoreio intensivo de produção tenha sido sujeita a medidas oficialmente ou com cortes curtos frequentes; controladas destinadas a eliminar o organismo preju- iii) Na primeira época de colheita de batata subse- dicial e a retirar qualquer material de plantas hospe- quente ao período especificado na subalínea anterior, deiras, incluindo, pelo menos, uma mudança completa e sob condição de o campo ter sido considerado livre do meio de cultura e a limpeza e desinfecção da uni- de batateiras espontâneas e de outras plantas hospe- dade de produção e de todo o equipamento e, em se- deiras naturais do organismo prejudicial durante ins- guida, que os serviços de inspecção fitossanitária da pecções oficiais, pelo menos, nos dois anos de cultura DRAP competente tenham concedido a aprovação para consecutivos antes da plantação, é permitida a produ- a produção de batata; e ção de batata de consumo ou de semente e os tubér- b) A produção de batata é realizada a partir de culos colhidos devem ser testados em conformidade batata de semente certificada ou de mini-tubérculos ou com o procedimento referido no anexo I; de micro-plantas provenientes de fontes testadas. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4095 4.2 — Na zona demarcada, sem prejuízo das medi- 1.2 — Antes da eliminação, os resíduos líquidos das a que se refere o n.º 4.1, os serviços de inspecção contendo sólidos em suspensão são sujeitos a filtração fitossanitária da DRAP competente: ou processos de decantação para remover tais sólidos, os quais são eliminados em conformidade com o refe- 4.2.1 — Exigem, imediatamente após a declaração de rido no n.º 1.1. contaminação, a limpeza e desinfecção de toda a ma- 1.2.1 — Os resíduos líquidos são, então: quinaria e dos armazéns das referidas instalações en- volvidas na produção da batata, consoante for apro- a) Aquecidos a uma temperatura mínima de 60° C priado, utilizando métodos adequados, tal como atingida em todo o volume durante, pelo menos, 30 mi- disposto no n.º 3; nutos antes da eliminação; ou 4.2.2 — Imediatamente após a declaração de conta- b) Eliminados através de outro método sujeito a minação e durante, pelo menos, três anos de cultura: aprovação e controlo oficial, por forma a que não exista nenhum risco identificável de que os resíduos i) Controlam, através dos serviços de inspecção, as possam entrar em contacto com as terras agrícolas, explorações que cultivem, armazenem ou manuseiem devendo os respectivos pormenores ser comunicados tubérculos de batata, assim como as explorações que aos restantes Estados membros e à Comissão Europeia. utilizem para o efeito maquinaria em regime de con- tratação; 2 — As opções descritas no presente anexo também ii) Exigem, para todas as culturas de batata da zona, se aplicam aos resíduos associados ao manuseamento, que só sejam plantadas batatas de semente certifica- à eliminação e à transformação de lotes contaminados. das ou sementes cultivadas sob controlo oficial e que sejam analisadas após colheita as culturas de batata de semente efectuadas em locais de produção declarados Decreto-Lei n.o 249/2007 como provavelmente contaminados nos termos da alí- de 27 de Junho nea d) do n.º 1 do artigo 6.º; iii) Exigem que os lotes de batata de semente e de A doença provocada pelo agente patogénico Ralstonia batata de consumo colhidos na zona sejam manusea- solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., vulgarmente das separadamente ou um sistema de limpeza e desin- designada por doença do pus ou mal murcho da batateira fecção entre o manuseamento de lotes para semente e e do mal murcho tomateiro, é um factor de redução para consumo; da produção da cultura da batateira e do tomateiro, iv) Realizam uma prospecção oficial nos termos do representando um risco para estas culturas não só no artigo 3.º; País como também em todo o território comunitário se não forem tomadas medidas de protecção eficazes. Tornou-se, pois, necessário estabelecer medidas de 4.2.3 — Estabelecem, quando adequado, um progra- controlo fitossanitário destinadas a evitar a introdução ma de substituição de todos os lotes de batata semen- e a dispersão daquele agente patogénico no território te ao longo de um período adequado. nacional, competindo, para o efeito, à Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural a definição, ANEXO V a elaboração, a coordenação e a aplicação do programa Eliminação de resíduos associáveis ao organismo nacional de prospecção do organismo prejudicial. prejudicial Neste contexto, foi publicado o Decreto-Lei n.o 494/99, de 18 de Novembro, transpondo a Directiva 1 — Os métodos de eliminação de resíduos oficial- n.o 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao mente aprovados referidos no n.º 1 do anexo IV devem controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi cumprir as seguintes disposições de forma a prevenir et al., que definiu os procedimentos a adoptar para a qualquer risco identificável de dispersão do organis- implementação do referido programa, através nomea- mo prejudicial: damente de disposições técnicas quanto à forma de con- servação das amostras testadas e rastreabilidade do orga- 1.1 — Os resíduos de batata (incluindo batatas re- nismo prejudicial. jeitadas e cascas de batata) e quaisquer outros resídu- Foi, entretanto, publicada a Directiva n.o 2006/63/CE, os sólidos associados às batatas (incluindo terra, pe- da Comissão, de 14 de Julho, que veio alterar os anexos II dras e outro detritos) são eliminados: a VII da Directiva n.o 98/57/CE, do Conselho, de 20 1.1.1 — Num local de eliminação adequado e ofici- de Julho. Estes anexos constituem praticamente todo almente aprovado em que não existam riscos identifi- o corpo da directiva e foram alterados, quer para fazer cáveis de fuga do organismo prejudicial para o ambi- face aos avanços significativos em termos da compreen- ente, por exemplo, através de escorrência para terras são da biologia, dos procedimentos de detecção e de agrícolas, sendo os resíduos enviados directamente para identificação do agente patogénico quer para enquadrar o local em condições de confinamento de forma a que a experiência obtida na luta contra aquele organismo não exista risco de perda de resíduos; ou prejudicial através da revisão de várias disposições téc- 1.1.2 — Por incineração; ou nicas relacionadas com as medidas de controlo. 1.1.3 — Por outras medidas, desde que se tenha No tocante aos procedimentos de detecção e de iden- concluído que não existe qualquer risco identificável tificação, foram introduzidos procedimentos recente- de propagação do organismo prejudicial, sendo essas mente desenvolvidos como a hibridação fluorescente in situ (FISH), a reacção em cadeia da polimerase (PCR), medidas comunicadas à Comissão Europeia e aos ou- bem como melhorias nos diversos métodos laboratoriais tros Estados membros. a utilizar. 4096 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 Quanto aos elementos técnicos das medidas de con- CAPÍTULO II trolo, introduzem-se disposições que permitem melhorar a forma de conservação das amostras testadas, no sentido Controlo do organismo prejudicial de assegurar a rastreabilidade do organismo prejudicial, a reunião dos elementos necessários para determinar a Artigo 3.o dimensão provável da contaminação, os pormenores da Prospecção oficial notificação de qualquer presença confirmada do orga- nismo prejudicial e da zona contaminada relevante e a 1 — Para efeitos do disposto no número anterior, a aplicação das medidas em locais de produção designados Direcção-Geral da Agricultura e Desenvolvimento como contaminados e no interior das zonas demarcadas. Rural (DGADR) define, elabora e coordena a aplicação Deste modo, face à obrigatoriedade de proceder à do programa nacional de prospecção do organismo pre- transposição da Directiva n.o 2006/63/CE, da Comissão, judicial, cuja execução se realiza anualmente. de 14 de Julho, aliada ao facto de ser necessário actua- 2 — A execução do programa de prospecção referido lizar, por um lado, não só todo o regime específico de no número anterior cabe aos serviços de inspecção fitos- medidas fitossanitárias aplicáveis mas também as refe- sanitária das direcções regionais de agricultura e pescas rências aos serviços oficiais com competências na maté- (DRAP) e dos correspondentes organismos das Regiões ria, e por outro, enquadrar tais disposições com o actual Autónomas dos Açores e da Madeira, nas respectivas regime fitossanitário aprovado pelo Decreto-Lei áreas de actuação. n.o 154/2005, de 6 de Setembro, importa que se opte 3 — As prospecções previstas no programa nacional por publicar um decreto-lei que comporte a consoli- são realizadas em conformidade com o disposto no n.o 1 dação legislativa de toda a matéria em apreço, revo- da secção II do anexo I do presente decreto-lei, que gando, em consequência, o citado Decreto-Lei dele faz parte integrante, e incidem obrigatoriamente n.o 494/99, de 18 de Novembro. sobre as plantas constantes da lista a que se refere a Foram ouvidos os órgãos de governo próprio das secção I do anexo I, a seguir designadas por materiais Regiões Autónomas. vegetais. Foi promovida a audição do Conselho Nacional do 4 — De acordo com a avaliação do risco de dispersão Consumo. do organismo prejudicial efectuada no decurso da exe- Assim: cução do programa referido no n.o 1, as prospecções Nos termos da alínea a) do n.o 1 do artigo 198.o da podem ser realizadas, utilizando métodos adequados, Constituição, o Governo decreta o seguinte: em zonas de produção de batata, tomate e outras sola- náceas e em viveiros de tomateiro, assim como em locais de transformação industrial e centros de embalagem. CAPÍTULO I 5 — Igualmente de acordo com a avaliação do risco Disposições gerais de dispersão do organismo prejudicial efectuada no decurso da execução do programa referido no n.o 1, Artigo 1.o as prospecções podem ainda incidir sobre outras plantas solanáceas, para além dos materiais vegetais, e infes- Transposição de directivas tantes da mesma família, águas superficiais utilizadas O presente decreto-lei transpõe para a ordem jurídica para rega dos materiais vegetais, resíduos líquidos de interna a Directiva n.o 2006/63/CE, da Comissão, de descarga e resíduos sólidos provenientes de instalações 14 de Julho, que altera os anexos II a VII da Directiva de transformação industrial de batata e tomate ou de n.o 98/57/CE, do Conselho, de 20 de Julho, relativa ao embalagem de batata, meios de cultura e solo, a seguir controlo de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi designados por outros materiais, recorrendo a métodos et al., procedendo, simultaneamente, à consolidação adequados, e, quando necessário, com colheita de amos- legislativa da transposição de ambas as directivas. tras que são submetidas a testes laboratoriais oficiais ou oficialmente controlados. 6 — O método de diagnóstico, detecção e identifi- Artigo 2.o cação do organismo prejudicial nos materiais vegetais Objecto é o referido no anexo II do presente decreto-lei, que dele faz parte integrante, devendo ser utilizado, nos 1 — O presente decreto-lei estabelece as medidas de outros materiais, qualquer outro método adequado ofi- controlo fitossanitário a adoptar em relação à bactéria cialmente aprovado. Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., cau- 7 — A DGADR deve comunicar anualmente à sadora da doença do pus ou mal murcho da batateira Comissão Europeia e aos demais Estados membros os e do mal murcho tomateiro, a seguir designada por orga- resultados da execução do programa nacional de pros- nismo prejudicial, no sentido de evitar o seu apareci- pecção do organismo prejudicial, em conformidade com mento, e, uma vez detectada, localizá-la e determinar o disposto no n.o 2 da secção II do anexo I. a sua distribuição, evitar a sua dispersão e combatê-la com vista à sua eventual erradicação. 2 — O disposto no presente decreto-lei é aplicável, Artigo 4.o sem prejuízo do disposto no Decreto-Lei n.o 154/2005, Dever de informação em relação ao organismo prejudicial de 6 de Setembro, que actualiza o regime fitossanitário que cria e define as medidas de protecção fitossanitária Qualquer pessoa que saiba ou suspeite da presença destinadas a evitar a introdução e dispersão no território do organismo prejudicial em qualquer dos materiais nacional e comunitário, incluindo nas zonas protegidas, vegetais ou nos outros materiais deve informar de ime- de organismos prejudiciais aos vegetais e produtos vege- diato os serviços de inspecção fitossanitária das DRAP tais qualquer que seja a sua origem ou proveniência. ou a DGADR. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4097 Artigo 5.o em contacto com os materiais vegetais em que tenha Procedimentos no caso de suspeita da presença sido colhida a amostra, declarar igualmente contami- do organismo prejudicial nados, quando for necessário, os campos, unidades de produção de culturas protegidas e locais de cultura em 1 — Considera-se estar perante uma ocorrência sus- que tenham sido colhidos os materiais vegetais e de peita quando a confirmação da presença do organismo que provém a amostra, declarar também contaminados, prejudicial se tenha verificado por meio de: no caso de amostras colhidas durante a época de cultura, a) Observação de sintomas de diagnóstico da doença os campos, locais de produção e, quando necessário, causada pelo organismo prejudicial e se obteve um resul- unidades de produção de culturas protegidas em que tado positivo no ou nos testes rápidos de rastreio, defi- tenha sido colhida a amostra; nidos no n.o 1 da secção I e na secção II do anexo II; ou iii) Determinar, em conformidade com o disposto no b) Obtenção de um resultado positivo no ou nos testes n.o 1 do anexo V do presente decreto-lei, do qual faz de rastreio definidos no n.o 2 da secção I e na secção III parte integrante, a extensão da contaminação provável do anexo II. por contacto pré ou pós-colheita ou por relação de pro- dução, irrigação ou relação clonal com a contaminação 2 — Em caso de ocorrência suspeita, os serviços de declarada; e inspecção fitossanitária da DRAP competente devem: iv) Demarcar uma zona com base na declaração de contaminação, na determinação da extensão da conta- a) Assegurar a realização de testes laboratoriais ofi- minação provável e na possível dispersão do organismo ciais ou oficialmente controlados, conforme previsto no prejudicial, em conformidade com o disposto na alínea i) n.o 6 do artigo 3.o, de acordo com as condições definidas do n.o 2 do anexo V; no n.o 1 do anexo III do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, a fim de confirmar ou refutar a c) Para as culturas de plantas hospedeiras diferentes ocorrência suspeita; das referidas na alínea anterior, quando considerarem b) Proibir a utilização e a circulação de plantas ou que está em risco a produção dos materiais vegetais: tubérculos de todas as colheitas, lotes ou remessas em que tenham sido colhidas amostras, excepto sob o seu i) Proceder a investigações nos termos da subalínea i) controlo e desde que se tenha concluído que não existe da alínea anterior; qualquer risco identificável de dispersão do organismo ii) Declarar contaminadas as plantas hospedeiras do prejudicial; organismo prejudicial em que tenha sido colhida a amos- c) Adoptar medidas adicionais a fim de determinar tra; e a origem da ocorrência suspeita e evitar a dispersão iii) Determinar a contaminação provável e demarcar do organismo prejudicial. uma zona nos termos das subalíneas iii) e iv) da alínea anterior, respectivamente, em relação à produção dos 3 — Nos casos de ocorrência suspeita relativamente materiais vegetais; à qual existam riscos de contaminação dos materiais vegetais ou das águas superficiais de ou para outro d) Para as águas superficiais, incluindo resíduos líqui- Estado membro, a DGADR deve comunicar imedia- dos de descarga de instalações de transformação indus- tamente, de acordo com o risco identificado, os orga- trial ou de embalagem que lidem com os materiais vege- nismos responsáveis dos Estados membros em causa, tais, e para solanáceas silvestres hospedeiras, quando bem como a Comissão Europeia, dos dados relativos considerarem que está em risco a produção dos materiais à citada ocorrência suspeita. vegetais, por via da irrigação, aspersão ou inundação por águas superficiais: Artigo 6.o i) Proceder a investigações, incluindo uma prospecção Procedimentos no caso de confirmação da presença oficial, nos momentos adequados, em amostras de águas do organismo prejudicial superficiais e de solanáceas silvestres hospedeiras, caso presentes, por forma a determinar a extensão da con- 1 — Sempre que a presença do organismo prejudicial taminação; e seja confirmada através dos testes laboratoriais referidos ii) Declarar contaminadas as águas superficiais em no n.o 6 do artigo 3.o, os serviços de inspecção fitos- que tenha ou tenham sido colhidas as amostras, na sanitária da DRA competente devem: medida em que tal seja apropriado e no seguimento a) Zelar pelo cumprimento dos procedimentos esta- das investigações referidas na subalínea anterior; e belecidos no n.o 2 do anexo III; iii) Determinar a contaminação provável e demarcar b) No que respeita aos materiais vegetais: uma zona, com base na declaração de contaminação, ao abrigo da subalínea anterior, e na possibilidade de i) Proceder a investigações para determinar a extensão dispersão do organismo prejudicial, tendo em conta o e a ou as fontes primárias da contaminação, de acordo disposto no n.o 1 e na alínea ii) do n.o 2 do anexo V. com o disposto no anexo IV do presente decreto-lei, do qual faz parte integrante, por meio de análises adi- 2 — A DGADR deve comunicar à Comissão Euro- cionais em conformidade com o disposto no n.o 6 do peia e aos restantes Estados membros qualquer con- artigo 3.o, em, pelo menos, todos os lotes de batata- taminação declarada: -semente com uma relação clonal; ii) Declarar contaminados os materiais vegetais, a) Nos termos das subalíneas ii) da alínea b) e ii) remessas e ou lotes em que tenha sido colhida a amostra, da alínea d) do número anterior; bem como as máquinas, veículos, recipientes, armazéns b) Dos pormenores respeitantes à demarcação da ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, zona nos termos da subalínea iv) da alínea b) do número incluindo material de embalagem, que tenham estado anterior; 4098 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 c) Quando aplicável, dos pormenores respeitantes à b) Nos restantes casos ou em todas as plantas de demarcação da zona nos termos da subalínea iii) da selecção clonal inicial ou em amostras representativas alínea d) do número anterior, nos termos do disposto da batata-semente base ou de material de propagação no n.o 3 do anexo V. anterior. Artigo 8.o 3 — A comunicação referida no número anterior é Notificação das medidas fitossanitárias acompanhada da comunicação adicional prevista no n.o 4 do anexo V. As medidas de protecção fitossanitária determinadas e mandadas aplicar são objecto de notificações oficiais Artigo 7.o emanadas das DRAP, dirigidas às pessoas singulares Medidas de protecção fitossanitária subsequentes e colectivas envolvidas. 1 — Os materiais vegetais declarados contaminados Artigo 9.o não podem ser plantados e sob controlo e aprovação dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP com- Encargos dos operadores económicos petente são sujeitos a um dos processos indicados no Os encargos resultantes da aplicação das medidas de n.o 1 do anexo VI e do anexo VII do presente decreto-lei, protecção fitossanitária referidas no número anterior do qual fazem parte integrante, em condições que garan- são suportados pelos respectivos operadores econó- tam que não existe qualquer risco reconhecido de dis- micos. persão do organismo prejudicial. Artigo 10.o 2 — Os materiais vegetais declarados como provavel- mente contaminados, incluindo os materiais vegetais que Proibição tenham sido considerados em risco, produzidos em É proibida a posse e manuseamento do organismo locais de cultura declaradas como provavelmente con- prejudicial. taminadas, não podem ser plantados e, sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária da DRAP com- Artigo 11.o petente, são utilizados de forma adequada ou eliminados Derrogações conforme especificado no n.o 2 do anexo VI, em con- dições que garantam que não existe qualquer risco reco- Para fins experimentais ou científicos e trabalhos de nhecido de dispersão do organismo prejudicial. selecção varietal, a DGADR pode autorizar a não exe- 3 — Toda a maquinaria, veículos, recipientes, arma- cução do disposto nos n.os 1 a 4 do artigo 7.o e no zéns ou respectivas partes e quaisquer outros objectos, artigo 10.o, para efeitos de aplicação do Decreto-Lei incluindo o material de embalagem declarados conta- n.o 91/98, de 14 de Abril, que estabelece as condições minados, ou considerados como provavelmente conta- pelas quais determinados organismos prejudiciais, vege- minados, são destruídos ou descontaminados segundo tais, produtos vegetais e outros materiais podem ser métodos adequados conforme especificado no n.o 3 do introduzidos ou circular na Comunidade ou em zonas anexo VI, sendo após a descontaminação esses objectos protegidas para fins experimentais ou científicos e tra- deixam de ser considerados contaminados. balhos de selecção de variedades. 4 — Sem prejuízo das medidas aplicadas nos termos dos números anteriores, na zona demarcada, são, tam- CAPÍTULO III bém, aplicadas as medidas especificadas nos n.os 4.1 e 4.2 do anexo VI. Regime contra-ordenacional 5 — Só é permitida a plantação de batata-semente desde que: Artigo 12.o Contra-ordenações a) Sejam satisfeitas as exigências estabelecidas no Decreto-Lei n.o 154/2005, de 6 de Setembro; 1 — As seguintes infracções constituem contra-orde- b) A batata seja proveniente, em linha directa, de nações puníveis com coima cujo montante mínimo é material obtido no âmbito de um programa oficialmente de E 100 e máximo de E 3740 ou mínimo de E 250 aprovado que tenha sido declarado isento do organismo e máximo de E 44 890, consoante o agente seja pessoa prejudicial em testes oficiais ou controlados oficial- singular ou colectiva: mente, utilizando o método referido no n.o 6 do artigo 4.o a) A omissão do dever de informação previsto no artigo 4.o; 6 — Os testes referidos na alínea b) do número ante- b) O não cumprimento das medidas de protecção rior devem ser realizados: fitossanitária determinadas e mandadas aplicar ao a) Quando tiver sido comprovada a presença do orga- abrigo do artigo 8.o e em violação do disposto nos arti- nismo prejudicial na própria produção de batata-se- gos 5.o e 7.o; mente: c) O não cumprimento dos encargos financeiros resul- tantes da aplicação das medidas de protecção fitossa- i) Através de análises de todo o material de pro- nitária a aplicar ao abrigo do artigo 8.o, em violação pagação anterior, incluindo a selecção clonal inicial, e do disposto no artigo 9.o; de análises sistemáticas de todos os clones de batata- d) A posse e o manuseamento do organismo pre- -semente de base; ou judicial, em violação do disposto no artigo 10.o ii) Quando tiver sido determinado que não existe rela- ção clonal inicial, através de análises de todos os clones 2 — A tentativa e a negligência são puníveis, sendo de batata-semente de base ou de material de propagação nesse caso reduzidos para metade os limites mínimos anterior, incluindo a selecção clonal inicial; e máximos referidos no número anterior. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4099 Artigo 13.o pelos organismos definidos pelos órgãos de governo Sanções acessórias próprio. 3 — As percentagens previstas no artigo 15.o prove- 1 — Em função da gravidade da infracção e da culpa nientes das coimas aplicadas nas Regiões Autónomas do agente, podem ser aplicadas, simultaneamente com dos Açores e da Madeira constituem receita própria as coimas, as seguintes sanções acessórias: de cada uma delas. a) Perda de objectos pertencentes ao agente; Artigo 17.o b) Interdição do exercício de profissões ou actividades Norma revogatória cujo exercício dependa de título público ou de auto- rização ou de homologação de autoridade pública; É revogado o Decreto-Lei n.o 494/99, de 18 de c) Privação do direito a subsídio ou benefício outor- Novembro. gado por entidades ou serviços públicos; Artigo 18.o d) Privação do direito de participar em feiras ou Remissão mercados; e) Encerramento de estabelecimento cujo funciona- Todas as referências feitas para o decreto-lei que mento esteja sujeito a autorização de autoridade admi- agora se revoga consideram-se feitas para o presente nistrativa; decreto-lei. f) Suspensão de autorizações. Visto e aprovado em Conselho de Ministros de 3 de Maio de 2007. — José Sócrates Carvalho Pinto de 2 — As sanções previstas no número anterior têm a Sousa — Luís Filipe Marques Amado — Fernando Tei- duração máxima de um ano. xeira dos Santos — Alberto Bernardes Costa — Francisco 3 — No caso de uma conduta contra-ordenacional ter Carlos da Graça Nunes Correia — Manuel António ocasionado um grave risco de propagação do organismo Gomes de Almeida de Pinho — Jaime de Jesus Lopes prejudicial, deve ser dada publicidade à decisão con- Silva. denatória definitiva de aplicação da coima, mediante a afixação de editais na sede da DRA da área onde Promulgado em 11 de Junho de 2007. foi praticada a infracção. Publique-se. O Presidente da República, ANÍBAL CAVACO SILVA. Artigo 14.o Processos de contra-ordenação Referendado em 14 de Junho de 2007. Sem prejuízo das competências atribuídas por lei às O Primeiro-Ministro, José Sócrates Carvalho Pinto de autoridades policiais e fiscalizadoras, o levantamento Sousa. dos autos e a instrução dos processos de contra-orde- nação são da competência da DRAP da região em cuja ANEXO I área foi praticada a contra-ordenação, competindo ao director-geral da Agricultura e Desenvolvimento Rural SECÇÃO I a aplicação das coimas e sanções acessórias. Lista de vegetais hospedeiros de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al. Artigo 15.o 1 — Plantas (incluindo tubérculos, com excepção da Produto das coimas semente verdadeira, de Solanum tuberosum L. (Batata). O produto das coimas reverte: 2 — Plantas, com excepção de frutos e sementes de Lycopersicon Lycopersicum (L.) Karsten ex Farw. (To- a) Em 10 % para a entidade que levantou o auto mate). de contra-ordenação; b) Em 10 % para a entidade que instruiu o processo; SECÇÃO II c) Em 20 % para a entidade que aplicou a coima; Prospecções d) Em 60 % para o Estado. 1 — As prospecções oficiais referidas no n.º 3 do artigo 3.º, são baseadas na biologia do organismo pre- CAPÍTULO IV judicial e nos sintomas de produção específica do País, Disposições finais devendo incluir: 1.1 — No caso da batata: Artigo 16.o a) Em alturas apropriadas, inspecção visual da cul- Aplicação às Regiões Autónomas tura em desenvolvimento e ou colheita de amostras de batata-semente e de batata consumo durante a época 1 — Sem prejuízo das competências atribuídas à de cultura ou em armazém, sendo que essas amostras DGADR na qualidade de autoridade fitossanitária são sujeitas a uma inspecção visual oficial ou oficial- nacional, as competências atribuídas pelo presente mente controlada, com corte dos tubérculos; e decreto-lei às DRAP são exercidas nas Regiões Autó- nomas dos Açores e da Madeira pelos organismos dos b) No caso da batata-semente e, quando apropria- departamentos regionais competentes. do, da batata consumo, análises laboratoriais oficiais 2 — As competências previstas no artigo 14.o são exer- ou oficialmente controladas, utilizando o método cons- cidas nas Regiões Autónomas dos Açores e da Madeira tante do anexo II. 4100 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 1.2 — No caso do tomate, inspecção visual em al- dos e pormenores respeitantes à preparação dos mate- turas apropriadas, pelo menos da cultura em desenvol- riais para realização dos testes e dos controlos. No vimento de plantas destinadas a replantação para utili- apêndice n.º 1 é fornecida uma lista dos laboratórios zação profissional. incluídos na optimização e validação de protocolos. 2 — A comunicação das prospecções oficiais, a que Uma vez que os protocolos envolvem a detecção de se refere o n.º 7 do artigo 3.º, deve incluir: um organismo de quarentena e incluem a utilização de 2.1 — No caso de prospecções em batata: culturas viáveis de R. solanacearum como materiais de controlo, é necessário realizar os procedimentos em a) Estimativa da superfície total de cultura de bata- ta-sememte e de batata consumo, em hectares; condições de quarentena adequadas, em instalações b) Descriminação por categoria de semente e cali- com sistemas apropriados de eliminação de resíduos e bre e, quando apropriado por região; possuindo as licenças adequadas, emitidas pelas auto- c) Número e data das amostras colhidas para análise; ridades oficiais competentes em matéria de quarente- d) Número de inspecções visuais da cultura; na fitossanitária. e) Número (e dimensão da amostra) de inspecções Os parâmetros dos ensaios devem garantir a detec- visuais de tubérculos. ção consistente e reprodutível de níveis de R. solana- cearum nos limiares estabelecidos para os métodos 2.2 — No caso de prospecções, pelo menos na cultu- seleccionados. ra em desenvolvimento, de plantas de tomateiro desti- É imperiosa a preparação rigorosa de controlos po- nadas a replantação para utilização profissional: sitivos. A realização dos ensaios de acordo com os limia- a) Estimativa do número total de plantas; res exigidos implica igualmente uma regulação, manu- b) Número de inspecções visuais. tenção e calibração correctas do equipamento, uma manipulação e conservação cuidadosas dos reagentes 2.3 — No caso de prospecções noutras plantas hos- e estabelecimento de todas as medidas destinadas a pedeiras, incluindo solanáceas silvestres hospedeiras: evitar contaminações entre amostras, por exemplo, a a) Espécie; separação de controlos positivos das amostras a tes- b) Número e data das amostras colhidas; tar. Devem ser aplicadas normas de controlo de quali- c) Área/rio, consoante o caso, em que foram colhi- dade a fim de evitar, nomeadamente, erros adminis- das as amostras; trativos, em especial no tocante à rotulagem e à d) Método analítico. documentação. Uma ocorrência suspeita, conforme referido no n.º 1 2.4 — No caso de prospecções em águas e descar- do artigo 5.º do presente decreto-lei, implica um resul- gas de resíduos líquidos provenientes de instalações de tado positivo nos testes de diagnóstico ou de rastreio transformação industrial ou de embalagem: efectuados numa amostra, conforme especificado nos fluxogramas a seguir indicados. Um primeiro teste de a) Número e data das amostras colhidas; rastreio positivo (teste IF, PCR/FISH, isolamento se- b) Área/rio/situação das instalações, consoante o lectivo) deve ser confirmado por um segundo teste de caso, em que foram colhidas as amostras; rastreio baseado num princípio biológico diferente. c) Método analítico. Caso o primeiro teste de rastreio seja positivo, sus- peita-se, então, de contaminação por R. solanacearum, ANEXO II devendo proceder-se a um segundo teste de rastreio. Caso o segundo teste de rastreio seja positivo, é con- Esquema de ensaio para diagnóstico, detecção e identifica- firmada a suspeita (ocorrência suspeita), devendo pros- ção de Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi et al., para efeitos do presente anexo designada por R. solana- seguir-se a verificação de acordo com o esquema. Caso cearum. o segundo teste de rastreio seja negativo, considera-se então que a amostra não está contaminada por R. so- Âmbito do esquema de ensaio lanacearum. O esquema de ensaio apresentado descreve os vári- A presença confirmada, conforme referido no no os procedimentos envolvidos: n.º 1 do artigo 6.º do presente decreto-lei, implica o iso- lamento e a identificação de uma cultura pura de i) No diagnóstico do pus em tubérculos de batatei- R. solanacearum com confirmação de patogenicidade. ra e de mal murcho em plantas de batateira, de toma- teiro e outras plantas hospedeiras; ii) Na detecção de R. solanacearum em amostras de SECÇÃO I tubérculos de batateira, em plantas de batateira, de to- Aplicação do esquema de ensaio mateiro e outras plantas hospedeiras, em água e no solo; 1 — Esquema para o diagnóstico do pus ou mal iii) Na identificação de R. solanacearum. murcho (R. solanacearum) em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro ou outras plantas Princípios gerais: hospedeiras com sintomas: Nos apêndices são apresentados os protocolos opti- O procedimento laboratorial destina-se a tubérculos mizados para os diversos métodos, reagentes valida- de batateira e a plantas com sintomas típicos ou sus- Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4101 peitos de pus ou mal murcho. Implica um teste rápido 2 — Esquema para detecção e identificação de R. de rastreio, isolamento do patogéneo a partir do teci- solanacearum em amostras de tubérculos de batateira do vascular infectado num meio de cultura (selectivo) assintomáticos: e, em caso de resultado positivo, identificação da cul- Princípio: tura como R. solanacearum. O procedimento laboratorial destina-se a detectar infecções latentes em tubérculos de batateira. Um Tubérculo(s) de batateira ou planta(s) de batateira, tomateiro ou outros hospedeiros com sintomas suspeitos de pus ou mal murcho (1) resultado positivo em, pelo menos, dois testes de ras- treio (3), com base em princípios biológicos diferen- TESTES RÁPIDOS DE DIAGNÓSTICO (2) tes, deve ser complementado com o isolamento do Realizar, pelo menos, um dos seguintes testes para diagnóstico preliminar: patogéneo, seguido, em caso de isolamento de colóni- - Teste de produção de exsudado bacteriano (3) - Teste de poli-Ƣ-hidroxibutirato (4) - Teste serológico de aglutinação (5) as típicas, de confirmação da identificação da cultura - Teste IF (6)/ Teste FISH (7)/ Teste ELISA (8)/ Teste PCR (9) pura como sendo R. solanacearum. Um resultado po- sitivo em apenas um dos testes de rastreio não é sufi- TESTE ESSENCIAL DE ISOLAMENTO (10) ciente para considerar a amostra suspeita. Os testes de rastreio e os testes de isolamento de- Colónias com morfologia típica (11) vem permitir detectar 103 a 104 células por ml de se- dimento ressuspenso, incluídos como controlos positi- NÃO (12) R. solanacearum não detectada amostra não infectada por vos em cada série de testes. R. solanacearum SIM Amostra de tubérculos de batateira (1) Purificar através de subcultura Extracção e concentração do patogéneo (2) TESTES DE TESTE DE IDENTIFICAÇÃO (13) PATOGENICIDADE (14) TESTES ESSENCIAIS DE RASTREIO (3) Teste IF (4)/ Isolamento selectivo (5)/Teste PCR (6)/ Teste FISH (7) Teste auxiliar opcional: ELISA (8)/ Ambos os testes confirmam a cultura pura como Primeiro teste de rastreio (3) sendo de R. solanacearum R. solanacearum não detectada Negativo amostra não infectada por Amostra não infectada por R. solanacearum NÃO R. solanacearum Positivo SIM Segundo teste de rastreio (3) R. solanacearum não detectada Negativo amostra não infectada por Amostra infectada por R. solanacearum R. solanacearum Positivo (1) A descrição dos sintomas é apresentada no n.º 1 da secção II. Isolamento selectivo (5) e/ou bioensaio (9) (2) Os testes rápidos de diagnóstico facilitam o diagnóstico inicial, mas não são essenciais. Um resultado negativo nem sem- Colónias com morfologia típica (10) pre garante a ausência do patogéneo. R. solanacearum não detectada (3) O teste de produção de exsudado bacteriano proveniente do NÃO (11) Amostra não infectada por R. solanacearum tecido vascular do caule é descrito n.º 1 da parte A da secção VI. SIM (4) O teste para detecção de grânulos de poli-â-hidroxibutirato Purificar através de subcultura em células bacterianas é descrito no n.º 2 da parte A da secção VI. (5) Os testes serológicos de aglutinação com exsudado bacte- riano ou extractos de material vegetal com sintomas são descritos TESTES DE TESTES DE IDENTIFICAÇÃO (12) PATOGENICIDADE (13) no n.º 3 da parte A da secção VI. (6) O teste IF com exsudado bacteriano em suspensão aquosa Ambos os testes confirmam a cultura pura como ou em extractos de material vegetal com sintomas é descrito no sendo de R. solanacearum n.º 5 da parte A da secção VI. Amostra não infectada por (7) O teste FISH com exsudado bacteriano em suspensão aquo- NÃO R. solanacearum sa ou em extractos de material vegetal com sintomas é descrito no SIM n.º 7 da parte A da secção VI. (8) O teste ELISA com exsudado bacteriano em suspensão aquo- Amostra infectada por R. solanacearum sa ou em extractos de material vegetal com sintomas é descrito no n.º 8 da parte A da secção VI. (9) O teste PCR com exsudado bacteriano em suspensão aquo- (1) A dimensão normal da amostra é de 200 tubérculos, embo- sa ou em extractos de material vegetal com sintomas é descrito no ra este procedimento possa ser usado com amostras menores, caso n.º 6 da parte A da secção VI. não se disponha de 200 tubérculos. (10) Regra geral, o patogéneo é facilmente isolado a partir de (2) Os métodos de extracção e concentração do patogéneo são material vegetal com sintomas através do teste de diluição em descritos no n.º 1.1 da secção III. placas (n.º 3 da secção II). (3) Se, pelo menos, dois testes baseados em princípios biológi- (11) A morfologia típica das colónias é descrita na alínea d) do cos diferentes forem positivos, deverá proceder-se ao isolamento e n.º 3 da secção II. à confirmação. Realizar, pelo menos, um teste de rastreio. Se este (12) Poderá não ser possível isolar a bactéria a partir de mate- teste for negativo, a amostra é considerada negativa. Caso este teste rial vegetal em fase avançada de infecção devido à competição e seja positivo, é necessário realizar um segundo ou mais testes de ou excessivo desenvolvimento de colónias de bactérias saprófitas. rastreio baseados em princípios biológicos diferentes para verifi- Caso os sintomas da doença sejam típicos mas o teste de isola- car o primeiro resultado positivo. Se o segundo ou mais testes mento seja negativo, deve repetir-se o isolamento, de preferência forem negativos, a amostra é considerada negativa. Não são ne- através de um teste de diluição em placas com meio selectivo. cessários mais testes. (13) Obtém-se uma identificação fiável de culturas puras de (4) O teste IF é descrito no n.º 5 da parte A da secção VI. presumíveis isolados de R. solanacearum através dos testes des- (5) O teste de isolamento selectivo é descrito n.º 4 da parte A critos na parte B da secção VI. A caracterização intra-especifica é da secção VI. facultativa mas recomendada para cada novo caso. (6) Os testes PCR são descritos no n.º 6 da parte A da secção VI. (14) O teste de patogenicidade é descrito na parte C da secção VI. (7) O teste FISH é descrito no n.º 7 da parte A da secção VI. 4102 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 (8) Os testes ELISA são descritos no n.º 8 da parte A da (11) O isolamento ou os bioensaios podem conduzir à obtenção secção VI. de falsos resultados negativos devido à competição ou inibição por (9) O bioensaio é descrito no n.º 9 da parte A da secção VI. bactérias saprófitas. Caso se obtenham resultados positivos nos (10) A morfologia típica das colónias é descrita na alínea d) do testes de rastreio, mas os testes de isolamento forem negativos, n.º 3 da secção II. deverão repetir-se os testes de isolamento. (11) O isolamento ou os bioensaios podem conduzir à obtenção (12) Obtém-se uma identificação fiável de culturas puras de de falsos resultados negativos devido à competição ou inibição por presumíveis isolados de R. solanacearum através dos testes des- bactérias saprófitas. Caso se obtenham resultados positivos claros critos na parte B da secção VI. nos testes de rastreio, mas os testes de isolamento sejam negati- (13) O teste de patogenicidade é descrito na parte C da secção VI. vos, repetir então os testes de isolamento com o mesmo sedimento ou colhendo tecido vascular adicional próximo da região do hilo dos tubérculos da mesma amostra já cortados e, se necessário, testar SECÇÃO II amostras adicionais. (12) Obtém-se uma identificação fiável de culturas puras de Métodos pormenorizados de detecção de R. solanacearum presumíveis isolados de R. solanacearum através dos testes des- em tubérculos de batateira e em plantas de batateira, tomateiro critos na parte B da secção VI. ou outras plantas hospedeiras com sintomas de pus ou mal murcho (13) O teste de patogenicidade é descrito na parte C da secção VI. 1 — Sintomas (ver http://forum.europa.eu.int/Public/ 3 — Esquema para detecção e identificação de R. irc/sanco/Home/main): solanacearum em amostras de plantas assintomáticas 1.1 — Sintomas em batateira: de batateira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras: Planta de batateira: Na fase inicial de infecção no campo, verifica-se Amostra de segmentos de caule (1) uma murchidão das folhas na parte superior da planta a temperaturas elevadas e durante o dia, com recupe- Extracção e concentração do patogéneo (2) ração à noite. Na fase inicial de murchidão, as folhas mantêm-se verdes mas, posteriormente, desenvolve-se TESTES ESSENCIAIS DE RASTREIO (3) Isolamento selectivo(4)/ Teste IF (5)/ Teste PCR (6)/ Teste FISH (7) uma clorose seguida de necrose. Observa-se também Teste auxiliar opcional: ELISA (8), bioensaio(9) epinastia. A murchidão de um rebento ou de toda a planta torna-se rapidamente irreversível, resultando no Colónias com morfologia típica (10) Resultados negativos em colapso e na morte da planta. O tecido vascular dos após isolamento todos os testes realizados caules de plantas afectadas cortados transversalmente apresenta-se necrosado e um exsudado bacteriano de NÃO (11) R. solanacearum não detectada Amostra não infectada por cor esbranquiçada emerge da superfície cortada ou R. solanacearum pode ser extraído apertando o caule entre os dedos. SIM Quando um caule cortado é colocado verticalmente em água, observa-se a exsudação de um líquido viscoso a Purificar através de subcultura partir dos feixes vasculares. Tubérculo de batateira: TESTES DE TESTE DE IDENTIFICAÇÃO (12) PATOGENICIDADE (13) Os tubérculos de batateira têm que ser cortados Ambos os testes confirmam a cultura pura como transversalmente junto do hilo (extremidade do esto- sendo de R.solanacearum lho) ou longitudinalmente sobre a extremidade do es- NÃO Amostra não infectada por tolho. Na fase inicial de infecção, verifica-se uma R. solanacearum coloração amarela vítrea ou castanha clara no anel SIM vascular, pelo qual emerge espontaneamente, após al- Amostra infectada por guns minutos, um exsudado bacteriano de cor creme R. solanacearum clara. Mais tarde, a descoloração vascular assume um tom castanho mais nítido e a necrose pode alastrar ao parênquima. Nas fases mais avançadas, a infecção (1) Ver n.º 2.1 da secção III para a dimensão recomendada das amostras. progride a partir do hilo e dos «olhos», nos quais se (2) Os métodos de extracção e concentração do patogéneo são pode manifestar exsudação bacteriana que origina a descritos no n.º 2.1 da secção III. adesão de partículas de terra. Podem apresentar-se le- (3) Se, pelo menos, dois testes baseados em princípios biológi- sões na epiderme de cor vermelha acastanhada, em cos diferentes forem positivos, deverá proceder-se ao isolamento e à confirmação. Realizar, pelo menos, um teste de rastreio. Se este ligeira depressão, por colapso interno dos tecidos vas- teste for negativo, a amostra é considerada negativa. Caso este teste culares. Nas fases avançadas da doença, é comum o seja positivo, é necessário realizar um segundo ou mais testes de desenvolvimento de podridões moles secundárias cau- rastreio baseados em princípios biológicos diferentes para verifi- car o primeiro resultado positivo. Se o segundo ou mais testes sadas por fungos ou bactérias. forem negativos, a amostra é considerada negativa. Não são ne- 1.2 — Sintomas no tomateiro: cessários mais testes. Planta de tomateiro: (4) O teste de isolamento selectivo é descrito no n.º 4 da parte Os primeiros sintomas visíveis são o aspecto fláci- A da secção VI. (5) O teste IF é descrito no n.º 5 da parte A da secção VI. do das folhas mais jovens. Em condições ambientais (6) Os testes PCR são descritos no n.º 6 da parte A da secção VI. favoráveis ao patogéneo (temperatura do solo de 25° C, (7) O teste FISH é descrito no n.º 7 da parte A da secção VI. humidade saturada), surge dentro de poucos dias a (8) Os testes ELISA são descritos no n.º 8 da parte A da epinastia e a murchidão de um lado ou de toda a plan- secção VI. (9) O bioensaio é descrito no n.º 9 da parte A da secção VI. ta, conduzindo ao total colapso da planta. Em condi- (10) A morfologia típica das colónias é descrita na alínea d) do ções menos favoráveis (temperatura do solo inferior a n.º 3 da secção II. 21° C), observa-se uma menor murchidão, mas pode Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4103 desenvolver-se no caule um grande número de raízes c) Transferir 50-100 μl da suspensão para um meio adventícias. Podem observar-se manchas hidrópicas nutritivo geral (NA, YPGA ou SPA, ver apêndice n.º 2) alongadas a partir da base do caule, que evidenciam a e ou para o meio de tetrazólio de Kelman (apêndice necrose do sistema vascular. Quando o caule é corta- n.º 2) e ou para um meio selectivo validado (por exem- do transversalmente, os seus tecidos vasculares apre- plo, SMSA, ver apêndice n.º 2). Espalhar ou efectuar sentam uma coloração acastanhada e exsudam gotas de um reticulado com uma técnica adequada de diluição líquido viscoso branco ou amarelado, que contêm cé- em placas. Se necessário, preparar um conjunto separa- lulas bacterianas. do de placas com uma suspensão diluída de células de 1.3 — Sintomas noutros hospedeiros: R. solanacearum Biovar 2 como controlo positivo; Plantas de Solanum dulcamara e S. nigrum: d) Incubar as placas durante 2 a 6 dias a 28° C: Em condições naturais, os sintomas de murchidão Em meios nutritivos gerais, os isolados virulentos são raramente observados nestas infestantes hospedei- de R. solanacearum produzem colónias de cor bran- ras, a menos que as temperaturas do solo ultrapassem co-pérola, achatadas, irregulares e fluidas, exibindo os 25° C ou que os níveis de inóculo sejam extrema- muitas vezes espirais características no centro. Formas mente elevados (por exemplo, no caso de S. nigrum avirulentas de R. solanacearum apresentam pequenas que cresce junto de plantas de batateira ou de toma- colónias butirosas redondas e não fluidas de colora- teiro doentes). Quando efectivamente ocorre a murchi- ção esbranquiçada; dão, os sintomas são iguais aos descritos para o toma- Nos meios de tetrazólio de Kelman e SMSA, as teiro. As plantas de S. dulcamara que não apresentam espirais são de cor vermelha viva. As formas aviru- murchidão e com os caules e raízes imersos em água lentas de R. solanacearum apresentam pequenas coló- podem apresentar uma coloração castanha clara dos nias butirosas redondas e não fluidas que são comple- tecidos vasculares em secções transversais da base do tamente vermelho-escuras. caule ou de outras partes do caule que se encontrem submersas. Mesmo na ausência de sintomas de mur- 4 — Testes de identificação de R. solanacearum: chidão, pode manifestar-se a presença de exsudado Testes para confirmar a identidade de presumíveis bacteriano a partir de cortes de tecido vascular ou isolados de R. solanacearum são descritos na parte B observar-se esse exsudado se o caule, cortado trans- da secção VI. versalmente, for colocado verticalmente em água. SECÇÃO III 2 — Testes rápidos de rastreio: Os testes rápidos de rastreio podem facilitar o diag- 1 — Métodos pormenorizados de detecção e identi- nóstico preliminar, mas não são essenciais. Utilizar um ficação de R. solanacearum em amostras de tubérculos ou mais dos seguintes testes validados: de batateira assintomáticos: 2.1 — Teste de exsudação do caule (ver n.º 1 da 1.1 — Preparação da amostra: parte A da secção VI.). 2.2 — Detecção de grânulos de poli-â-hidroxibutirato Nota. — A dimensão normal da amostra é de 200 tu- (PHB): bérculos por teste. Uma amostragem mais intensiva Os grânulos característicos de PHB nas células de R. exige a realização de mais testes em amostras desta solanacearum são visualizados através da coloração com dimensão. Uma amostra com um maior número de azul de Nilo A ou com negro de Sudão de esfregaços tubérculos conduzirá à incapacidade ou a uma maior de exsudado bacteriano provenientes de tecido vegetal dificuldade de interpretação dos resultados. Contudo, infectado fixados pelo calor numa lâmina de microscó- este procedimento pode ser aplicado a amostras com pio (ver n.º 2 da parte A da secção VI). menos de 200 tubérculos, sempre que este número de tubérculos não se encontre disponível. 2.3 — Testes serológicos de aglutinação (ver n.º 3 A validação de todos os métodos de detecção abai- da parte A da secção VI.). xo descritos tem por base a análise de amostras cons- 2.4 — Outros testes: tituídas por 200 tubérculos. Outros testes rápidos de rastreio considerados apro- O extracto de batata descrito em seguida pode tam- priados são o teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI), bém ser utilizado para a detecção da bactéria Clavi- o teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI), os testes bacter michiganensis subsp. sepedonicus, responsável ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI) e os testes pela podridão anelar da batateira. PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI). 3 — Isolamento: Pré-tratamento opcional antes da preparação da a) Retirar o exsudado ou secções do tecido necro- amostra: sado do anel vascular do tubérculo ou da zona vascu- a) Incubação de amostras a uma temperatura de 25- lar do caule da planta de batateira, tomateiro ou ou- 30 C durante um período de até 2 semanas, para favo- tras plantas hospedeiras com sintomas de murchidão. recer a multiplicação de populações de Efectuar uma suspensão num pequeno volume de água R. solanacearum; destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM b) Lavar os tubérculos. Utilizar desinfectantes (com- (apêndice n.º 4) e deixar em repouso durante 5 a 10 mi- postos de cloro sempre que se utilizar o teste PCR para nutos; destruir ADN de organismos saprófitas) e detergentes b) Preparar uma série de diluições decimais da sus- adequados entre cada amostra. Secar os tubérculos ao pensão; ar. Este procedimento de lavagem é particularmente útil 4104 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 (mas não obrigatório) para amostras que apresentem dos para cada amostra foram recentemente esteriliza- um excesso de terra e quando se pretende realizar um dos. Caso se utilize o teste PCR, evitar a contamina- teste PCR ou um isolamento directo. ção por ADN dos recipientes ou instrumento de tritu- ração. Sempre que se utilize o teste PCR, recomenda-se 1.1.1 — Remover a epiderme na zona do hilo de a trituração em sacos descartáveis e a utilização de cada tubérculo com um bisturi ou faca de cortar legu- tubos descartáveis. mes, limpos e desinfectados, de forma que o tecido vascular fique visível. Retirar cuidadosamente um pe- 1.1.3 — Decantar o sobrenadante. Caso se encontre queno cone de tecido vascular na zona do hilo, redu- excessivamente turvo, clarificar através de centrifuga- zindo ao mínimo a quantidade de tecido não vascular ção a baixa velocidade (a não mais de 180 g durante (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/san- 10 minutos a uma temperatura entre 4 e 10 °C) ou de co/Home/main). filtração por vácuo (40-100 μm), lavando o filtro com tampão de extracção adicional (10 ml). Nota. — Pôr de lado quaisquer tubérculos (com 1.1.4 — Concentrar a fracção bacteriana por centri- podridões) que exibam sintomas suspeitos de pus ana- fugação a 7000 g durante 15 minutos (ou 10000 g lisá-los separadamente. durante 10 minutos) a uma temperatura entre 4 e 10 °C Caso se observem sintomas suspeitos de pus duran- e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. te a remoção do cone da zona do hilo, deve proceder- 1.1.5 — Ressuspender o sedimento em 1,5 ml de se a uma inspecção visual do tubérculo em questão e tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4). Utilizar 500 este deverá ser cortado próximo do hilo. Qualquer μl para R. solanacearum, 500 μl para Clavibacter tubérculo cortado exibindo sintomas suspeitos deve ser michiganensis subsp. sepedonicus e 500 μl para fins mantido durante, pelo menos, dois dias à temperatura de referência. Adicionar glicerol esterilizado até obter ambiente, no sentido de permitir a suberização, e em uma concentração final de 10-25 % (v/v) aos 500 μl seguida armazenado numa área refrigerada (entre 4 a das alíquotas de referência e à alíquota remanescente 10° C) em condições de quarentena adequadas. Todos da amostra em estudo; agitar em vortex e armazenar os tubérculos, incluindo os que apresentam sintomas entre -16 e -24 °C (semanas) ou entre –68 e –86 °C suspeitos, devem ser conservados de acordo com o (meses). Manter a alíquota remanescente da amostra anexo III. em estudo a uma temperatura entre 4 e 10 °C durante o período de ensaio. 1.1.2 — Colocar os cones dos hilos em recipientes Não se aconselha a congelação e descongelação descartáveis não utilizados que possam ser fechados e repetidas. ou selados (caso os recipientes sejam reutilizados de- Caso seja necessário transportar o extracto, garantir vem ser cuidadosamente limpos e desinfectados com a entrega numa caixa refrigerada num prazo de 24 a compostos de cloro). Os cones dos hilos devem ser, 48 horas. de preferência, processados de imediato. Se tal não for 1.1.6 — É indispensável que todas as amostras e con- possível, devem ser mantidos no recipiente, sem adi- trolos positivos de R. solanacearum sejam tratados sepa- ção de tampão, em local refrigerado durante, no má- radamente para evitar contaminações. O mesmo se apli- ximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente. ca às lâminas de imunofluorescência e a todos os testes. Processar os cones dos hilos de acordo com um dos 1.2 — Ensaio: seguintes procedimentos: Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos optimizados nos respectivos apêndices: a) Cobrir os cones com um volume suficiente (cer- ca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice n.º 4) Isolamento selectivo (ver n.º 4 da parte A da e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) duran- secção VI); te 4 horas a uma temperatura inferior a 24º C, ou Teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI); durante 16-24 horas refrigerados; ou Testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI); b) Homogeneizar os cones com um volume sufici- Teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI); ente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apên- Testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI); dice n.º 4) num misturador (por exemplo, Waring Blen- Bioensaio (ver n.º 9 da parte A da secção VI). der ou Ultra Thurrax) ou por esmagamento num saco 2 — Métodos pormenorizados de detecção e identi- de maceração descartável selado (por exemplo, Stoma- ficação de R. solanacearum em amostras de plantas cher ou Bioreba, em polietileno resistente, de 150 mm assintomáticas de batateira, tomateiro ou outras plan- x 250 mm, esterilizado por radiação) utilizando um tas hospedeiras: macete de borracha ou um instrumento de trituração 2.1 — Preparação da amostra: adequado (por exemplo, Homex). Nota. — Para a detecção de populações latentes de Nota. — O risco de contaminação cruzada das amos- R. solanacearum, é aconselhável a análise de amostras tras é elevado quando estas são homogeneizadas com compostas. O procedimento pode ser aplicado conve- recurso a um misturador. Tomar as precauções neces- nientemente a amostras compostas contendo até 200 par- sárias para evitar a formação de aerossóis ou derra- tes de caule. Sempre que forem realizadas prospecções, mes durante o processo de extracção. Assegurar-se de estas devem basear-se numa amostra estatisticamente que as lâminas e os recipientes do misturador utiliza- representativa da população de plantas em estudo. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4105 2.1.1 — Recolher segmentos de caule de 1-2 cm b) Processar imediatamente, esmagando os segmentos num recipiente esterilizado fechado, de acordo com os num saco de maceração resistente (por exemplo, Stoma- seguintes procedimentos de amostragem: cher ou Bioreba) com um volume adequado de tampão de extracção (apêndice n.º 4), com recurso a um macete Plântulas de tomateiro de viveiro: de borracha ou um instrumento de trituração adequado Com uma faca limpa e desinfectada, remover um (por exemplo, Homex). Se tal não for possível, armaze- segmento de 1 cm da base de cada caule, imediatamen- nar os segmentos de caule refrigerados durante, no má- te acima do nível do solo. ximo, 72 horas, ou 24 horas à temperatura ambiente. Plantas de tomateiro cultivadas no campo ou em estufa: 2.1.3 — Decantar o sobrenadante após 15 minutos de repouso. Com uma faca limpa e desinfectada, remover o re- 2.1.4 — Não é normalmente necessário proceder à bento lateral inferior de cada planta, cortando-o ime- clarificação do extracto ou à concentração da fracção diatamente acima do ponto de junção com o caule bacteriana, mas estes objectivos podem alcançar-se principal. Remover o segmento inferior de 1 cm de através de filtração e ou centrifugação, tal como des- cada rebento lateral. crito nos n.os 1.1.3 a 1.1.5 da secção III. 2.1.5 — Dividir o extracto puro ou concentrado da Outros hospedeiros: amostra em duas partes iguais. Manter uma metade a Com uma faca ou uma tesoura de poda limpas e de- uma temperatura de 4 a 10 °C durante a realização dos sinfectadas, remover um segmento de 1 cm da base de testes e armazenar a outra metade com 10-25 % (v/v) cada caule, imediatamente acima do nível do solo. No de glicerol esterilizado a uma temperatura compreen- caso da S. dulcamara ou de outras plantas hospedeiras dida entre –16 e –24 °C (semanas) ou –68 e –86 °C aquáticas, retirar secções de 1-2 cm dos caules ou esto- (meses), caso seja necessário proceder a mais testes. lhos que se encontrem submersos com raízes aquáticas. 2.2 — Ensaio: Ver fluxograma e descrição dos testes e protocolos Ao colher amostras de um determinado local, reco- optimizados nos respectivos apêndices: menda-se a análise de uma amostra estatisticamente Isolamento selectivo (ver n.º 4 da parte A da secção VI; representativa de, pelo menos, 10 plantas de cada po- Teste IF (ver n.º 5 da parte A da secção VI); tencial hospedeiro infestante por ponto de amostragem. Testes PCR (ver n.º 6 da parte A da secção VI); A detecção do patogéneo será mais fiável no final da Teste FISH (ver n.º 7 da parte A da secção VI); Primavera, no Verão e no Outono, embora se possam Testes ELISA (ver n.º 8 da parte A da secção VI); detectar infecções naturais durante todo o ano em Bioensaio (ver n.º 9 da parte A da secção VI). S. dulcamara perene que cresce em cursos de água. Al- guns hospedeiros conhecidos incluem plantas da bata- SECÇÃO IV teira espontâneas (zorras), S. dulcamara, S. nigrum, Datura stramonium e outros membros da família So- 1 — Esquema para detecção e identificação de R. lanaceae. Outros hospedeiros são o Pelargonium spp. solanacearum em água: e Portulaca oleracea. Algumas espécies de infestan- Amostra de água (1) tes europeias que podem ser potenciais hospedeiros de populações de R. solanacearum Biovar 2/Raça 3 nas Concentração do patogéneo (2) raízes e ou rizosfera, em condições ambientais especí- ficas, incluem Atriplex hastata, Bidens pilosa, Ceras- TESTE ESSENCIAL DE RASTREIO tium glomeratum, Chenopodium album, Eupatorium Isolamento selectivo (3) Testes auxiliares opcionais: bioensaio (4)/ PCR com enriquecimento (5)/ ELISA com enriquecimento (6) cannabinum, Galinsoga parviflora, Ranunculus sclera- tus, Rorippa spp., Rumex spp., Silene alba, S. nutans., Colónias com morfologia típica (7) após isolamento Tussilago farfarra e Urtica dioica. R. solanacearum não detectada NÃO (8) Nota. — O exame visual dos sintomas internos (ne- Amostra não contaminada por R. solanacearum crose vascular ou produção de exsudado bacteriano) SIM pode ser feito nesta fase. Pôr de lado qualquer seg- Purificar através de subcultura mento de caule que exiba sintomas e testá-lo separa- damente (ver secção II). TESTES DE IDENTIFICAÇÃO (9) TESTE DE PATOGENICIDADE (10) 2.1.2 — Desinfectar rapidamente os segmentos de caule Ambos os testes confirmam a cultura pura como sendo de R. solanacearum com etanol a 70 % e secar imediatamente com papel absorvente. Em seguida, processar os segmentos de cau- NÃO Amostra não contaminada por R. solanacearum le de acordo com um dos seguintes procedimentos: SIM a) Cobrir os segmentos com um volume suficiente (cerca de 40 ml) de tampão de extracção (apêndice Amostra contaminada por R. solanacearum n.º 4) e colocá-los num agitador rotativo (50-100 rpm) durante 4 horas a uma temperatura inferior a 24 °C ou (1) Ver n.º 2.1 da secção IV para os procedimentos de amostra- durante 16-24 horas em local refrigerado; ou gem recomendados. 4106 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 (2) Os métodos de concentração do patogéneo estão descri- em pontos de amostragem designados aumentará a fia- tos no n.º 2.1 da secção IV. A concentração aumenta as popula- ções de patogéneos e de bactérias saprófitas concorrentes e só bilidade da detecção pela redução dos efeitos da varia- é recomendada se não resultar na inibição do isolamento da ção climática. bactéria. Ter em conta os efeitos das fortes precipitações e a (3) O teste de isolamento selectivo é descrito no n.º 4 da parte geografia do curso de água, para evitar os efeitos de A da secção VI. (4) O bioensaio é descrito no n.º 9 da parte A da secção VI. uma diluição exagerada, que poderão camuflar a pre- (5) Os testes PCR com enriquecimento são descritos nos n.os 4.2 sença do patogéneo. e 6 da parte A da secção VI. Recolher amostras de águas superficiais na pro- (6) Os testes ELISA com enriquecimento são descritos n.os 4.2 e 8 da parte A da secção VI. ximidade de plantas hospedeiras, caso estas exis- (7) A morfologia típica das colónias é descrita na alínea d) do tam. n.º 3 da secção II. (8) Poderá não ser possível isolar a bactéria devido à competi- ção ou inibição por bactérias saprófitas. Caso se suspeite que a 2.1.1 — Nos pontos de amostragem seleccionados, existência de elevados níveis populacionais de saprófitas afecta a recolher amostras de água enchendo tubos ou fras- fiabilidade do isolamento, repetir o isolamento após diluição da cos esterilizados e descartáveis, se possível, a uma amostra em água esterilizada. (9) Obtém-se uma identificação fiável de culturas puras de pre- profundidade superior a 30 cm e a menos de 2 m sumíveis isolados de R. solanacearum através dos testes descritos da margem. Para os efluentes da transformação de na parte B da secção VI. batata e de esgotos, recolher amostras no ponto de (10) O teste de patogenicidade é descrito na parte C da secção VI. descarga dos efluentes. Recomenda-se que o volu- me das amostras não deverá ultrapassar os 500 ml por ponto de amostragem. Caso se prefiram amos- 2 — Métodos de detecção e identificação de R. so- tras mais pequenas, é aconselhável recolher amos- lanacearum em água: Princípio: tras, pelo menos, três vezes por ponto de amostra- O esquema de detecção validado descrito nesta gem, devendo cada amostra ser constituída por duas secção é aplicável à detecção do patogéneo em subamostras duplicadas de, pelo menos, 30 ml cada. amostras de águas superficiais, podendo também ser Para prospecções mais intensivas, seleccionar pelo aplicado a amostras de efluentes de transformação menos três pontos de amostragem por cada 3 km de de batata ou de esgotos. Contudo, é importante no- curso de água e certificar-se de que são também re- tar que a sensibilidade de detecção esperada irá colhidas amostras dos afluentes que entram no cur- variar consoante o substrato. A sensibilidade do teste so de água. de isolamento é afectada pelas populações de bac- 2.1.2 — Transportar as amostras refrigera- térias saprófitas competidoras, normalmente muito das 4-10 °C) e no escuro e testá-las no prazo de superiores nos efluentes de transformação de batata 24 horas. e de esgotos do que nas águas superficiais. Embora 2.1.3 — Caso seja necessário, a fracção bacteria- se espere que o esquema a seguir descrito detecte, na pode ser concentrada por um dos seguintes mé- pelo menos, 103 células por litro nas águas superfi- todos: ciais, a sensibilidade de detecção nos efluentes de a) Centrifugar subamostras de 30-50 ml a 10000 g transformação de batata e de esgotos deverá ser durante 10 minutos (ou a 7000 g durante 15 minu- bastante inferior. Por isso, recomenda-se que se tes- tos), de preferência a uma temperatura entre 4 e tem os efluentes depois de quaisquer tratamentos de 10 °C, desprezar o sobrenadante e ressuspender o purificação (por exemplo, sedimentação ou filtração), sedimento em 1 ml de tampão de ressuspensão (apên- durante os quais os níveis populacionais de bacté- dice n.º 4); ou rias saprófitas diminuem. Devem considerar-se as li- b) Filtração com membrana (dimensão mínima do mitações em termos de sensibilidade do esquema de ensaio, ao avaliar a fiabilidade de eventuais resulta- poro de 0,45 μm), seguida de lavagem do filtro com dos negativos obtidos. Embora este esquema tenha 5-10 ml de tampão de ressuspensão e recuperação das sido usado com êxito em prospecções para determi- suspensões resultantes da lavagem. Este método é ade- nar a presença ou ausência do patogéneo em águas quado para volumes maiores de água contendo um superficiais, devem reconhecer-se as limitações do reduzido número de saprófitas; seu uso em prospecções semelhantes de efluentes de transformação de batata ou de esgotos. Em geral, não se aconselha a concentração para 2.1 — Preparação da amostra: amostras de efluentes de transformação de batata ou de esgotos, dado que a existência de níveis Nota. — A detecção de R. solanacearum em águas populacionais mais elevados de bactérias saprófi- superficiais é mais fiável no final da Primavera, no tas competidoras inibirá a detecção da R. solana- Verão e no Outono, quando a temperatura da água é cearum. superior a 15° C. 2.2 — Ensaio: A realização de amostragens repetidas em diferen- Ver fluxograma e descrição dos testes nos respecti- tes momentos do período mencionado anteriormente vos apêndices. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4107 SECÇÃO V sença ou ausência do patogéneo em solos ou em la- mas. O teste mais fiável para detectar a presença do 1 — Esquema para detecção e identificação de R. patogéneo num campo consiste em plantar um hospe- solanacearum no solo: deiro susceptível e controlá-lo para detectar uma even- Amostra de terra (1) tual infecção, mas, mesmo com este método, não se- rão detectados os baixos níveis de contaminação. Extracção do patogéneo 2.1 — Preparação da amostra: 2.1.1 — A recolha de amostras de solo de um cam- TESTE ESSENCIAL DE RASTREIO Isolamento selectivo (2) po deve seguir os princípios comuns usados para a Teste auxiliar opcional: PCR com enriquecimento (3)/ bioensaio (4) amostragem de nemátodos. Recolher 0,5-1 kg de solo por amostra de 60 locais por cada 0,3 ha, a uma pro- Colónias com morfologia Resultados negativos fundidade de 10-20 cm (ou numa grelha de 7x7 me- típica (5) após isolamento em todos os testes tros). Caso se suspeite de presença do patogéneo, au- mentar o número de pontos de recolha para 120 por R. solanacearum não detectada NÃO (6) Amostra não contaminada por 0,3 ha. Manter as amostras a 12-15 °C antes do seu R. solanacearum SIM processamento. Para as amostras de resíduos proveni- entes da transformação de batata ou de lamas de de- Purificar através de subcultura puração, recolher um total de 1 kg dos locais repre- sentativos do volume total dos resíduos e lamas a TESTES DE TESTE DE IDENTIFICAÇÃO (7) PATOGENICIDADE (8) testar. Misturar bem cada uma das amostras antes de efectuar os testes. Ambos os testes confirmam a cultura pura como sendo de R. solanacearum 2.1.2 — Dispersar subamostras de 10-25 g de solos, resíduos sólidos de transformação de batata ou lamas NÃO Amostra não contaminada por R. solanacearum num agitador rotativo (250 rpm) em 60-150 ml de SIM tampão de extracção (apêndice n.º 4) durante um perí- odo máximo de duas horas. Se necessário, pode auxi- Amostra contaminada por R. solanacearum liar-se a dispersão mediante adição de 0,02 % de Tween-20 e de 10-20 g de cascalho esterilizados. 2.1.3 — Manter a suspensão a 4° C durante os testes. (1) Ver n.º 2.1 da secção V para os procedimentos de amostra- 2.2 — Ensaio: gem recomendados. (2) O teste de isolamento selectivo é descrito no n.º 4 da parte A Ver fluxograma e descrição dos testes nos respecti- da secção VI. vos apêndices. (3) Os testes PCR com enriquecimento são descritos nos n.os 4.2 e 6 da parte A da secção VI. SECÇÃO VI (4) O bioensaio é descrito no n.º 9 da parte A da secção VI. Protocolos optimizados para detecção e identificação (5) A morfologia típica das colónias é descrita na alínea d) do de R. solanacearum n.º 3 da secção II. (6) Poderá não ser possível isolar a bactéria devido à competi- PARTE A ção ou inibição por bactérias saprófitas. Caso se suspeite que a existência de elevados níveis populacionais de saprófitas afecta a Testes de diagnóstico e detecção fiabilidade do isolamento, repetir o isolamento após diluição da amostra em água esterilizada. 1 — Teste de exsudação do caule: (7) Obtém-se uma identificação fiável de culturas puras de pre- A presença de R. solanacearum em caules de bata- sumíveis isolados de R. solanacearum através dos testes descritos teira, tomateiro ou outras plantas hospedeiras com sin- na parte B da secção VI. (8) O teste de patogenicidade é descrito na parte C da secção VI. tomas de murchidão pode ser avaliada através de um simples teste inicial: cortar o caule imediatamente aci- ma do nível do solo. Suspender a superfície cortada 2 — Métodos de detecção e identificação de R. so- num tubo de ensaio com água límpida. Passados al- lanacearum no solo: guns minutos, procurar observar uma exsudação bac- Princípios: teriana espontânea característica a partir dos feixes O esquema de detecção validado descrito nesta sec- vasculares. ção é aplicável à detecção do patogéneo em amostras 2 — Detecção de grânulos de poli-â-hidroxibutirato: de solo, embora possa também ser usado para análise de amostras de resíduos sólidos de transformação de 1) Preparar um esfregaço do exsudado bacteriano batata ou de lamas de depuração. Deve notar-se, po- proveniente do tecido infectado ou de uma cultura de rém, que estes métodos não são suficientemente sen- 48 horas em meio YPGA ou SPA (apêndice n.º 2) síveis para garantir a detecção de populações baixas numa lâmina de microscópio; e/ou dispersas de modo irregular de R. solanacearum 2) Preparar esfregaços de controlo positivo com uma que podem ocorrer em amostras naturalmente conta- estirpe de R. solanacearum Biovar 2 e, se necessário, minadas desses substratos. um esfregaço de uma espécie reconhecidamente nega- Devem considerar-se as limitações em termos de tiva no teste PHB como controlo negativo; sensibilidade deste esquema de ensaio, ao avaliar a 3) Deixar secar ao ar e, em seguida, passar rapida- fiabilidade dos resultados negativos obtidos e também mente a parte inferior de cada lâmina à chama para quando usado em prospecções para determinar a pre- fixar os esfregaços; 4108 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4) Corar a preparação com azul de Nilo ou negro extractos de tecido sintomático é mediante a utiliza- de Sudão e observar ao microscópio de acordo com o ção de anticorpos marcados validados (ver apêndice procedimento a seguir descrito: n.º 3), utilizando marcadores corados adequados como, Teste de azul de Nilo: por exemplo, células de Staphylococcus aureus ou partículas de látex coradas. Em caso de utilização de a) Cobrir cada lâmina com uma solução aquosa a 1 % de azul de Nilo A e incubar durante 10 minutos material disponível no mercado (ver apêndice n.º 3), a uma temperatura de 55 °C; seguir as instruções do fabricante. Caso contrário, apli- b) Sacudir as gotas de solução corante. Lavar bre- car o procedimento seguinte: vemente e com cuidado em água corrente. Retirar o a) Misturar gotas de uma suspensão de anticorpos excesso de água com papel absorvente; marcados e exsudado bacteriano (aproximadamente c) Cobrir o esfregaço com uma solução aquosa a 5 μl de cada) nos poços de lâminas multiteste; 8 % de ácido acético e incubar durante um minuto à b) Preparar controlos positivos e negativos utilizan- temperatura ambiente; do suspensões de R. solanacearum Biovar 2 e de uma d) Lavar brevemente e com cuidado em água corrente. estirpe heteróloga, Retirar o excesso de água com papel absorvente; c) Depois de homogeneizar com cuidado durante e) Voltar a humedecer com uma gota de água e 15 segundos, observar a produção de aglutinação nas cobrir com uma lamela; amostras positivas. f) Examinar o esfregaço corado coberto com uma gota de óleo de imersão em microscópio de epifluo- 4 — Isolamento selectivo: rescência a 450 nm, utilizando uma objectiva de imer- 4.1 — Diluição em placas com meio selectivo: são em óleo ou água e uma ampliação de 600-1000X; g) Os grânulos de PHB apresentam uma fluorescência Nota. — Antes de utilizar este método pela primei- laranja viva. Observar também com luz normal transmi- ra vez, efectuar testes preliminares para garantir a tida para verificar se os grânulos são intracelulares e se detecção reprodutível de 103 a 104 unidades formado- a morfologia das células é típica de R. solanacearum. ras de colónias (ufc) de R. solanacearum por ml adi- cionadas a extractos de amostras que apresentaram Teste do negro de Sudão: anteriormente resultados negativos. a) Corar cada lâmina com uma solução a 0,3 % de Utilizar um meio selectivo devidamente validado, negro de Sudão B em etanol a 70 % e incubar duran- como o SMSA (alterado por Elphinstone et al., 1996, te 10 minutos à temperatura ambiente; ver apêndice n.º 2). b) Sacudir as gotas de solução corante e lavar bre- É necessário estar atento de forma a diferenciar R. vemente em água corrente, retirando o excesso de água solanacearum de outras bactérias que possam desen- com papel absorvente; volver colónias no meio. Além disso, as colónias de c) Mergulhar as lâminas brevemente em xilol e se- R. solanacearum podem apresentar morfologia atípica car sobre papel absorvente. em caso de sobrepopulação das placas ou se estive- rem também presentes bactérias antagonistas. Se se Nota. — Cuidado! O xilol é um produto nocivo. suspeitar de efeitos de competição ou antagonismo, a Tomar as medidas de segurança necessárias e traba- amostra deve ser reanalisada utilizando um teste dife- lhar em «hotte». rente. Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais d) Corar as lâminas com uma solução aquosa a elevada com este método quando se utilizam extrac- 0,5 % (p/v) de safranina e incubar durante 10 segun- tos de amostras recentemente preparados. No entanto, dos à temperatura ambiente; o método pode também ser aplicado a extractos que tenham sido armazenados em glicerol a uma tempera- Nota. — Cuidado! A safranina é um produto noci- tura compreendida entre – 68 e – 86 °C. vo. Tomar as medidas de segurança necessárias e tra- balhar em «hotte». Como controlos positivos, preparar diluições deci- mais de uma suspensão de 106 ufc por ml de uma e) Lavar com cuidado em água corrente, secar em estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2 (por papel absorvente e cobrir com uma lamela; exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857). f) Examinar os esfregaços corados cobertos com óleo Para evitar qualquer possibilidade de contaminação, os de imersão em microscópio com luz transmitida e com controlos positivos devem ser sempre preparados à uma ampliação de 1000X, utilizando uma objectiva de parte das amostras a testar. imersão em óleo; A boa qualidade de cada novo lote de meio selec- g) Os grânulos de PHB em células de R. solanace- tivo para o crescimento do patogéneo deve ser testada arum apresentam uma coloração azul negra e as pare- antes da sua utilização para a análise de amostras de des celulares apresentam uma coloração rosa. rotina. Testar o material de controlo de forma idêntica à 3 — Testes serológicos de aglutinação: da(s) amostra(s). A melhor forma de observar a aglutinação de célu- 4.1.1 — Aplicar uma técnica de diluição em placas las de R. solanacearum em exsudado bacteriano ou adequada, a fim de garantir a diluição de eventuais Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4109 populações saprófitas formadoras de colónias. Espalhar, 4.2.1 — Para o teste PCR com enriquecimento, por placa, 50-100 μl de extracto de amostra por cada transferir 100 μl de extracto de amostra para 10 ml diluição. de meio líquido de enriquecimento (apêndice n.º 2) 4.1.2 — Incubar as placas a 28 °C. Observar as pla- previamente separado em alíquotas para tubos ou fras- cas após 48 horas e em seguida diariamente durante cos isentos de ADN. Para o teste ELISA com enri- um período de até 6 dias. As colónias típicas de R. quecimento podem utilizar-se diluições mais concen- solanacearum em SMSA apresentam, de início, uma tradas do extracto da amostra (por exemplo 100 μl em cor branca leitosa, são achatadas, irregulares e fluidas 1,0 ml de caldo de enriquecimento). e após 3 dias de incubação o centro adquire uma co- 4.2.2 — Incubar durante 72 horas a uma temperatu- loração rosa a vermelho-vivo com estrias ou espirais ra compreendida entre os 27 e 30 °C em cultura agi- internas (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/ tada ou estática, mantendo as tampas dos recipientes irc/sanco/Home/main). apertadas frouxamente para permitir o arejamento. 4.2.3 — Misturar bem antes de utilizar nos testes Nota. — Neste meio formam-se por vezes colónias ELISA ou PCR. atípicas de R. solanacearum, que podem ser pequenas, 4.2.4 — Tratar o meio líquido enriquecido de modo redondas, completamente vermelhas e não fluidas ou idêntico ao da(s) amostra(s) nos testes acima referidos. apenas parcialmente fluidas e, portanto, difíceis de dis- tinguir de bactérias saprófitas formadoras de colónias. Nota. — Se for de prever a inibição do enriqueci- mento de R. solanacearum devido à existência de gran- 4.1.3 — Purificar as presumíveis colónias de R. so- des populações de certas bactérias saprófitas competi- lanacearum por reticulado ou diluição em placas num doras, poderão conseguir-se melhores resultados com meio nutritivo geral a fim de obter colónias isoladas o enriquecimento dos extractos de amostras antes de (ver apêndice n.º 2). se efectuar uma centrifugação ou outros processos de 4.1.4 — Armazenar as culturas a curto prazo em concentração. água desionizada esterilizada (pH 6-8) à temperatura ambiente, no escuro, ou a longo prazo num meio crio- 5 — Teste IF: protector adequado entre – 68 e –86 °C ou liofilizadas. Princípio: 4.1.5 — Identificar culturas de presumíveis isolados A utilização do teste IF como teste de rastreio es- de R. solanacearum (ver parte B da secção VI) e efec- sencial é recomendada, tendo em conta a sua robustez tuar um teste de patogenicidade (ver parte C da comprovada para alcançar os limiares de detecção secção VI). exigidos. Interpretação dos resultados da diluição em placas Sempre que se utilize o teste IF como teste de ras- com meio selectivo: treio essencial e o seu resultado seja positivo, terá de O teste de diluição em placas com meio selectivo é se realizar o teste de isolamento, o teste PCR ou o negativo se não for observada nenhuma colónia bac- teste FISH como segundo teste de rastreio. Sempre que teriana ao fim de seis dias ou se não forem encontra- se utilize o teste IF como segundo teste de rastreio e das colónias presumivelmente características de R. o seu resultado seja positivo, terão de se realizar mais solanacearum, desde que não se suspeite de inibição testes de acordo com o fluxograma para completar a resultante de concorrência ou antagonismo de outras análise. bactérias e que sejam detectadas colónias característi- cas de R. solanacearum nos controlos positivos. Nota. — Utilizar anticorpos validados para R. sola- O teste de diluição em placas com meio selectivo é nacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Pu- positivo se forem isoladas colónias de presumíveis iso- blic/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determina- lados de R. solanacearum. ção do título para cada novo lote de anticorpos. O 4.2 — Operação de enriquecimento: título é definido como a diluição mais elevada para a Utilizar um meio de enriquecimento validado, como qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma o caldo Wilbrink modificado (ver apêndice n.º 2). suspensão contendo 105 a 106 células por ml de uma Este procedimento pode ser utilizado para aumentar estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a selectivamente as populações de R. solanacearum nos um conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC), extractos de amostras e aumentar a sensibilidade de de acordo com as recomendações do fabricante. To- detecção. Este procedimento também dilui de forma dos os anti-soros policlonais validados têm um título eficaz os inibidores da reacção da PCR (1:100). Impor- de IF de 1:2000 no mínimo. Durante o teste os anti- ta referir, no entanto, que o enriquecimento de R. sola- corpos devem ser utilizados em diluições de trabalho nacearum pode ser infrutífero devido à competição ou próximas do título ou no seu valor exacto. ao antagonismo de organismos saprófitas, que em mui- O teste deve ser realizado com extractos de amos- tos casos são enriquecidos simultaneamente. Por esta tras recentemente preparados. Se necessário, pode ser razão, o isolamento de R. solanacearum a partir de executado com sucesso com extractos armazenados meios líquidos de cultura enriquecidos pode ser difícil. entre –68 e –86 °C e conservados em glicerol. O gli- Além disso, como as populações de saprófitas serologi- cerol pode ser retirado da amostra através da adição camente afins podem aumentar, recomenda-se a utiliza- de 1 ml de tampão de ressuspensão (apêndice n.º 4), ção de anticorpos monoclonais específicos em vez de nova centrifugação durante 15 minutos a 7000 g e anticorpos policlonais quando se utilize o teste ELISA. ressuspensão num volume igual de tampão de ressus- 4110 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 pensão. Este procedimento é frequentemente desne- 5.3 — Procedimento IF: cessário, em especial se as lâminas forem fixadas à i) De acordo com a preparação da lâmina descrita chama. na alínea i) do n.º 5.1: Preparar lâminas de controlo positivo em separado com uma estirpe homóloga, ou qualquer outra estirpe Preparar um conjunto de diluições a 1/2 do anti-soro de referência de R. solanacearum, suspensa em extrac- em tampão IF. O primeiro poço deverá ter 1/2 do tí- to de batata, tal como especificado na parte B do apên- tulo (T/2), os restantes 1/4 do título (T/4), 1/2 do títu- dice n.º 3 ou opcionalmente em tampão. lo (T/2), o título (T) e o dobro do título (2T); Sempre que possível, deve também ser utilizado material vegetal naturalmente infectado (liofilizado ou ii) De acordo com a preparação da lâmina descrita congelado a uma temperatura compreendida entre –16 na alínea ii) do n.º 5.1: e –24 °C) como controlo positivo na mesma lâmina. Preparar a diluição de trabalho (DT) do anticorpo Como controlos negativos, podem ser utilizadas alí- em tampão IF. A diluição de trabalho afecta a especi- quotas de extracto de amostra que se tenham anterior- ficidade. mente revelado negativas relativamente à presença de FIGURA N.º 1 R. solanacearum. Preparação da lâmina de acordo com a alínea i) do n.º 5.1 e a alínea i) do n.º 5.3 Os materiais normalizados de controlo positivo e negativo que podem ser utilizados neste teste são re- Diluições do sedimento ressuspenso feridos no apêndice n.º 3. 1/100 1/1 1/1 1/1 1/1 Ƒ Diluição do sedimento Utilizar lâminas de microscópio com vários poços, ressuspenso de preferência 10, com, pelo menos, 6 mm de diâme- tro cada. (T = Título) T/2 T/4 T/2 T 2T Ƒ Diluições 1/2 do anti- Testar o material de controlo de forma idêntica à soro/anticorpo Amostra 1 Ɣ1 Ɣ2 Ɣ3 Ɣ4 Ɣ5 da(s) amostra(s). 5.1 — Preparar as lâminas através de um dos seguin- Duplicado da Ɣ6 Ɣ7 Ɣ8 Ɣ9 Ɣ 10 amostra 1 ou tes procedimentos: amostra 2 i) Para sedimentos com relativamente pouco amido: FIGURA N.º 2 Pipetar um volume-padrão (15 μl é adequado para poços com 6 mm de diâmetro — aumentar o volume Preparação da lâmina de acordo com a alínea ii) proporcionalmente à dimensão dos poços) de uma di- do n.º 5.1 e a alínea ii) do n.º 5.3 luição de 1/100 do sedimento de batata ressuspenso Diluição de trabalho do anti-soro/anticorpo no primeiro poço. Em seguida, pipetar um volume si- 1/1 1/10 1/100 Vazio Vazio Ƒ Diluição decimal do milar de sedimento não diluído (1/1) nos restantes sedimento ressuspenso poços da fila. A segunda fila de poços pode ser utili- Amostra 1 Ɣ1 Ɣ2 Ɣ3 Ɣ4 Ɣ5 zada como um duplicado ou para outra amostra, como Duplicado da Ɣ6 Ɣ7 Ɣ8 Ɣ9 Ɣ 10 indicado na figura n.º 1; amostra 1 ou amostra 2 ii) Para outros sedimentos: 5.3.1 — Dispor as lâminas sobre papel absorvente Preparar diluições decimais (1/10, 1/100) do sedi- humedecido. Cobrir por completo cada poço a testar mento ressuspenso em tampão de ressuspensão. Pipe- com a(s) diluição(ões) de anticorpo. O volume de an- tar um volume-padrão (15 μl é adequado para poços ticorpo adicionado a cada poço deve ser, pelo menos, com 6 mm de diâmetro — aumentar o volume propor- igual ao volume de extracto aplicado. cionalmente à dimensão dos poços) do sedimento res- O procedimento seguinte deverá ser efectuado na suspenso e de cada uma das diluições numa fila de ausência de instruções específicas dos fornecedores dos poços. A segunda fila de poços pode ser utilizada anticorpos: como um duplicado ou para outra amostra, como in- 5.3.2 — Incubar as lâminas sobre papel humedeci- dicado na figura n.º 2. do durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a 25 °C) numa caixa opaca fechada. 5.2 — Secar as gotículas à temperatura ambiente ou 5.3.3 — Sacudir as gotículas de cada lâmina e la- por aquecimento a uma temperatura compreendida var cuidadosamente com tampão IF. Lavar por submer- entre 40 e 45 °C. Fixar as células bacterianas na lâmi- são durante 5 minutos em tampão IF-Tween (apêndi- na por aquecimento (15 minutos a 60 °C), à chama, ce n.º 4) e subsequentemente em tampão IF. Evitar a com etanol a 95 %, ou em conformidade com instru- transferência de aerossóis ou de gotículas, o que po- ções específicas dos fornecedores dos anticorpos. deria dar origem a uma contaminação cruzada. Elimi- Se necessário, as lâminas assim tratadas podem ser nar cuidadosamente a humidade em excesso, secando armazenadas congeladas numa caixa de dessecação suavemente com papel absorvente. durante o menor tempo possível (até um máximo de 3 5.3.4 — Dispor as lâminas sobre papel humedecido. meses) antes de serem testadas. Cobrir os poços a testar com a diluição do conjugado Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4111 FITC utilizada para determinar o título. O volume de Nota. — A leitura do teste IF revela um resultado conjugado adicionado aos poços deve ser idêntico ao positivo para amostras com, pelo menos, 5x103 célu- volume de anticorpo utilizado. las típicas por ml de sedimento ressuspenso. A amos- 5.3.5 — Incubar as lâminas sobre papel humedeci- tra é considerada como potencialmente contaminada, do durante 30 minutos à temperatura ambiente (18 a sendo necessário efectuar outros testes. 25 °C) numa caixa opaca fechada. 5.3.6 — Sacudir da lâmina as gotículas de conjuga- ii) A leitura do teste IF revela um resultado negati- do. Lavar como anteriormente (n.º 5.3.3). vo para amostras com menos de 5x103 células por ml Retirar cuidadosamente o excesso de humidade. de sedimento ressuspenso sendo a amostra considera- 5.3.7 — Pipetar para cada poço 5-10 μl de uma da negativa. A realização de outros testes não é obri- solução de tampão fosfato 0,1 M com glicerol (apên- gatória. dice n.º 4), ou de um líquido de montagem disponível no mercado que evite a perda rápida de fluorescência, 6 — Testes PCR: e cobrir com uma lamela. Princípios: 5.4 — Leitura do teste IF: Sempre que se utilize PCR como teste de rastreio 5.4.1 — Examinar as lâminas do teste num micros- principal e o seu resultado seja positivo, tem de se re- cópio de epifluorescência, com filtros adequados para alizar o teste de isolamento ou o teste IF como segun- excitação do FITC, utilizando uma lente de imersão do teste obrigatório de rastreio. Sempre que se utilize o em óleo ou água, com uma ampliação de 500-1000X. teste PCR como segundo teste de rastreio e o seu re- Examinar os poços ao longo de dois diâmetros per- sultado seja positivo, terão de se realizar mais testes de acordo com o fluxograma para completar o diagnóstico. pendiculares e à volta do perímetro. Para amostras que A exploração completa deste método como teste de não revelem células, ou cujo número seja reduzido, rastreio principal é apenas recomendada quando tenham observar, pelo menos, 40 campos do microscópio. sido adquiridos conhecimentos altamente especializados. Observar primeiro a lâmina do controlo positivo. As células devem apresentar-se com uma fluorescência Nota. — Os resultados preliminares obtidos com este brilhante e completamente coradas no título do anti- teste deveriam permitir a detecção reprodutível de 103 corpo ou diluição de trabalho determinados. O teste IF a 104 células de R. solanacearum por ml adicionadas (n.º 5 da parte A da secção VI) deve ser repetido se a a extractos de amostras que apresentaram anteriormente coloração for aberrante. resultados negativos. Podem ser necessárias experiên- 5.4.2 — Procurar células fluorescentes brilhantes cias de optimização para alcançar os níveis máximos com a morfologia característica de R. solanacearum de sensibilidade e especificidade em todos os labora- nos poços em estudo das lâminas a testar (ver http:// tórios. forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A intensidade de fluorescência deve ser equivalente à da Utilizar os reagentes e protocolos PCR validados estirpe do controlo positivo, para a mesma diluição do (ver apêndice n.º 6). Seleccionar, de preferência, um anticorpo. As células com coloração incompleta ou método que disponha de um controlo interno. com fluorescência fraca não devem ser consideradas. Tomar as precauções necessárias para evitar a con- Caso se suspeite de qualquer contaminação, o teste taminação da amostra com ADN-alvo. O teste PCR deve ser repetido. Este pode ser o caso quando todas deve ser realizado por técnicos experimentados, em as lâminas de um lote revelem células positivas devi- laboratórios de biologia molecular especializados, no do à contaminação do tampão ou se forem encontra- sentido de minimizar a possibilidade de contaminação das células positivas (fora dos poços da lâmina) no com ADN-alvo. revestimento da lâmina. Os controlos negativos (para os procedimentos de 5.4.3 — Há vários problemas inerentes à especifici- extracção de ADN e PCR) devem ser sempre mani- dade do teste de imunofluorescência. Em sedimentos pulados como amostras finais no procedimento, a fim de cones de hilo e de segmentos de caule da batatei- de evidenciar a ocorrência de qualquer contaminação ra, é possível a ocorrência de populações de células com ADN. fluorescentes com morfologia atípica e reacções cru- Devem ser incluídos no teste PCR os seguintes zadas de bactérias saprófitas com dimensões e morfo- controlos negativos: logia semelhantes a R. solanacearum. Extracto de amostra que tenha anteriormente sido 5.4.4 — Considerar apenas células fluorescentes testado e se tenha revelado negativo relativamente à com dimensões e morfologia típicas no título ou na presença de R. solanacearum; diluição de trabalho dos anticorpos, tal como descri- Controlos dos tampões utilizados para extrair a bac- to em 5.3. téria e o ADN da amostra; 5.4.5 — Interpretação da leitura do teste IF: Mistura de reacção de PCR. i) Se forem detectadas células fluorescentes brilhan- tes e com a morfologia característica, determinar o Devem ser incluídos os seguintes controlos positivos: número médio de células típicas por cada campo do Alíquotas de sedimentos ressuspensos às quais se microscópio e calcular o número de células típicas por adicionou R. solanacearum (ver preparação na parte ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 5); B do apêndice n.º 3); 4112 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 Uma suspensão em água contendo 106 células por 12) Adicionar 500 μl de etanol a 80 % (-20 °C) e ml de um isolado virulento de R. solanacearum (por misturar invertendo o tubo; exemplo, NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver 13) Centrifugar a 15000 g durante 10 minutos a parte B do apêndice n.º 3); 4 °C, guardar o sedimento e remover o etanol; Se possível, utilizar também ADN extraído de amos- 14) Deixar secar o sedimento ao ar ou em «DNA tras positivas ao realizar o teste PCR. speed vac»; 15) Ressuspender o sedimento em 100 μl de água Nota. — Para evitar uma potencial contaminação, os ultra pura (UPW) esterilizada e deixar à temperatura controlos positivos deverão ser preparados num ambi- ambiente durante, pelo menos, 20 minutos; ente separado do das amostras a serem testadas. 16) Armazenar a –20 °C até ser necessário para a realização de PCR; Os extractos de amostras devem estar, o mais pos- 17) Centrifugar qualquer precipitado branco até que sível, isentos de terra. É, por isso, prudente, em cer- este se deposite no fundo e utilizar 5 μl do sobrena- tos casos, preparar os extractos a partir de material dante contendo ADN para PCR. vegetal, caso se utilizem os testes PCR. Os materiais normalizados de controlo positivo e b) Outros métodos: negativo que podem ser utilizados para este teste es- Podem ser aplicados outros métodos de extracção tão mencionados no apêndice n.º 3. de ADN, por exemplo o Qiagen DNeasy Plant Kit, 6.1 — Métodos de purificação do ADN: desde que esteja provado que são igualmente eficazes Utilizar amostras de controlo positivo e negativo, tal na purificação do ADN a partir de amostras de con- como acima descrito (ver apêndice n.º 3). trolo contendo 103 a 104 células do patogéneo por ml. Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s). 6.2 — PCR: Existe uma variedade de métodos para a purifica- 6.2.1 — Preparar as amostras a testar e controlos ção de ADN-alvo a partir de amostras de substratos para PCR em conformidade com os protocolos vali- complexos, removendo, deste modo, os inibidores de dados (n.º 6 da parte A da secção VI). Preparar uma PCR e outras reacções enzimáticas e concentrando o diluição decimal de extracto de ADN da amostra (1:10 ADN-alvo no extracto de amostra. O método seguinte em UPW). foi optimizado para utilização com os métodos PCR 6.2.2 — Preparar a mistura adequada de reacção validados referidos no apêndice n.º 6: PCR num ambiente isento de contaminação, de acor- a) Método de acordo com Pastrik (2000): do com os protocolos publicados (apêndice n.º 6). Quando possível, recomenda-se a utilização de um 1) Pipetar 220 μl de tampão de lise (NaCl 100 mM, protocolo PCR multiplex que incorpore também um Tris-HCl 10 mM [pH 8,0], EDTA 1 mM [pH 8,0]) controlo interno de PCR. para um tubo Eppendorf de 1,5 ml; 6.2.3 — Adicionar 2-5 μl de extracto de ADN à 2) Adicionar 100 μl de extracto de amostra e colo- mistura de reacção de PCR de forma a obter um vo- car num bloco de aquecimento ou em banho-maria a lume final de 25 μl em tubos PCR esterilizados de 95 °C durante 10 minutos; acordo com os protocolos PCR (ver apêndice n.º 6). 3) Colocar o tubo em gelo durante 5 minutos; 6.2.4 — Incorporar uma amostra de controlo nega- 4) Adicionar 80 μl de solução concentrada de liso- tiva contendo apenas mistura de reacção PCR e adici- zima (50 mg de lisozima por ml em Tris HCl 10 mM, onar a mesma fonte de UPW utilizada na mistura PCR pH 8,0) e incubar a 37 °C durante 30 minutos; em vez da amostra. 5) Adicionar 220 μl de solução A Easy DNA® (In- 6.2.5 — Colocar os tubos no mesmo termociclador vitrogen), misturar bem em vortex e incubar a 65 °C que foi utilizado nos testes preliminares e iniciar o pro- durante 30 minutos; grama devidamente optimizado de PCR (apêndice n.º 6). 6) Adicionar 100 μl de solução B Easy DNA® (In- 6.3 — Análise do produto PCR vitrogen), agitar vigorosamente em vortex até que o 6.3.1 — Proceder à electroforese em gel de agarose precipitado se desloque livremente no tubo e a amos- dos fragmentos amplificados por PCR. Correr, pelo tra esteja uniformemente viscosa; menos, 12 μl de mistura de reacção contendo o ADN 7) Adicionar 500 μl de clorofórmio e agitar em amplificado de cada uma das amostras, misturados com vortex até que a viscosidade diminua e a mistura se 3 μl de tampão de carregamento (apêndice n.º 6) em torne homogénea; géis de agarose a 2,0 % (p/v) em tampão de tris ace- 89 Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4 °C tato-EDTA (TAE) (apêndice n.º 6) a 5-8 V por cm. para separar as fases e formar a interfase; Utilizar um marcador de ADN adequado, por exem- 9) Transferir a fase superior para um novo tubo plo, «100 bp ladder». Eppendorf; 6.3.2 — Revelar as bandas de ADN através de co- 10) Adicionar 1 ml de etanol a 100 % (-20 °C), loração em brometo de etídio (0,5 mg por l) durante agitar brevemente em vortex e incubar no gelo duran- 30-60 minutos, tomando as precauções adequadas te 10 minutos; para manusear este agente mutagénico. 11) Centrifugar a 15000 g durante 20 minutos a 4 °C 6.3.3 — Observar o gel corado num transiluminador e remover o etanol do sedimento; com UV de ondas curtas (ë = 302 nm) para detecção Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4113 de produtos amplificados de PCR de tamanho espera- com este método deveria permitir a detecção reprodu- do (apêndice n.º 6) e documentar. tível de, pelo menos, 103 a 104 células de R. solana- 6.3.4 — Para todas as novas detecções/situações, cearum por ml adicionadas a extractos de amostras que verificar a autenticidade do fragmento amplificado se revelaram negativos. por PCR através da realização de análise de restri- ção enzimática numa amostra do ADN amplificado O procedimento seguinte deve ser realizado, de pre- restante, por incubação com uma enzima de restri- ferência, com um extracto de amostra preparado na ção e um tampão adequados à temperatura e com altura da utilização, mas pode também ser realizado duração óptimas (ver apêndice n.º 6). Proceder, tal com sucesso com um extracto de amostra que tenha como anteriormente, à electroforese em gel de aga- sido armazenado em glicerol a uma temperatura com- rose dos fragmentos digeridos e observar o padrão preendida entre -16 e –24 °C ou –68 e –86 °C. característico dos fragmentos de restrição num tran- Como controlos negativos, utilizar alíquotas de siluminador com UV, após coloração com brometo extracto de amostra que tenha anteriormente sido de etídio, e comparar com o controlo positivo não testado com resultado negativo para R. solanacea- digerido e digerido. rum. Interpretação do resultado do teste PCR: Como controlos positivos preparar suspensões con- O teste PCR é considerado negativo caso o frag- tendo 105 a 106 células de R. solanacearum Biovar mento amplificado por PCR de tamanho específico 2 por ml (por exemplo, estirpe NCPPB 4156 = PD esperado para R. solanacearum não seja detectado 2762 = CFBP 3857, ver apêndice n.º 3) em tampão para a amostra em estudo, mas seja detectado em fosfato (PB) 0,01 M, a partir de uma cultura com 3 todas as amostras de controlo positivo (no caso de a 5 dias. Preparar lâminas de controlo positivo em PCR multiplex com iniciadores de controlo interno específicos para as plantas, deverá ser detectado um separado com a estirpe homóloga, ou qualquer outra segundo produto PCR de tamanho esperado na amos- estirpe de referência de R. solanacearum, suspensa tra em estudo). em extracto de batata, tal como especificado na par- O teste PCR é considerado positivo caso seja de- te B do apêndice n.º 3. tectado o fragmento amplificado por PCR específico A utilização de sondas para eubacterias marcadas para R. solanacearum de tamanho e padrão de restri- com FITC oferece um controlo para o processo de ção esperados (quando exigido), desde que não seja hibridação, visto que todas as eubactérias presentes na amplificado a partir de nenhuma das amostras de con- amostra ficarão coradas. trolo negativo. A confirmação fiável de um resultado Os materiais normalizados de controlo positivo e positivo pode também ser obtida mediante a repetição negativo que podem ser utilizados para este teste são do teste com um segundo conjunto de iniciadores de enumerados na parte A do apêndice n.º 3. PCR (apêndice n.º 6). Testar o material de controlo de forma idêntica à da(s) amostra(s). Nota. — Pode suspeitar-se de inibição de PCR se o 7.1 — Fixação do extracto de batata: fragmento amplificado esperado for observado na O protocolo seguinte tem por base Wullings et al. amostra de controlo positivo de uma suspensão aquo- (1998): sa de R. solanacearum, mas se obtenham resultados 7.1.1 — Preparar a solução fixadora (ver apêndi- negativos de controlos positivos de R. solanacearum ce n.º 7). em extracto de batata. Nos protocolos PCR multiplex 7.1.2 — Pipetar 100 μl de cada extracto de amostra com controlos internos de PCR, a inibição da reacção para um tubo Eppendorf e centrifugar durante 7 mi- é indicada sempre que não se obtenha nenhum dos dois nutos a 7000 g. fragmentos amplificados esperados. 7.1.3 — Remover o sobrenadante e dissolver o se- dimento em 200 μl de fixador preparado há menos de Pode suspeitar-se de contaminação caso o fragmen- 24 horas. Agitar em vortex e incubar durante 1 hora to amplificado esperado seja obtido em um ou vários no frigorífico. dos controlos negativos. 7.1.4 — Centrifugar durante 7 minutos a 7000 g, 7 — Teste FISH: remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em Princípio: 75 μl de PB 0,01M (ver apêndice n.º 7). Sempre que se utilize o teste FISH como primeiro 7.1.5 — Colocar 16 μl das suspensões fixadas numa teste de rastreio e o seu resultado seja positivo, tem de se realizar o teste de isolamento ou o teste IF como lâmina multiteste limpa, tal como demonstrado na fi- segundo teste obrigatório de rastreio. Sempre que se gura n.º 3. Aplicar duas amostras não diluídas diferen- utilize o teste FISH como segundo teste de rastreio e tes por lâmina e utilizar 10 μl para obter uma dilui- o seu resultado seja positivo, tem de se realizar mais ção de 1:100 (em PB 0,01 M). A solução de amostra testes de acordo com o fluxograma para completar o restante (49 μl) pode ser armazenada a – 20 ºC após diagnóstico. adição de 1 volume de etanol a 96 %. Caso o teste FISH exija uma repetição, remover o etanol por cen- Nota. — Utilizar sondas validadas específicas para trifugação e adicionar igual volume de PB 0,01 M R. solanacearum (apêndice n.º 7). O teste preliminar (agitar em vortex). 4114 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 FIGURA N.º 3 gativas) presentes na amostra mostram uma coloração Configuração para a lâmina FISH verde fluorescente. Com um filtro para isotiocianato- 5-tetrametilrodamina, as células de R. solanacearum Amostra 1 Branco Branco Branco Amostra 2 ż ż ż ż ż coradas com Cy3 revelam-se vermelho fluorescente. Poço 1 Poço 2 Poço 3 Poço 4 Poço 5 Comparar a morfologia das células com a dos contro- Amostra 1 Branco Branco Branco Amostra 2 los positivos. As células devem apresentar-se com uma ż Poço 6 ż Poço 7 ż Poço 8 ż Poço 9 ż Poço 10 fluorescência brilhante e completamente coradas. O Lamela 1 Lamela 2 teste FISH (n.º 7 da parte A da secção VI) deve ser repetido se a coloração for aberrante. Examinar os 7.1.6 — Secar as lâminas ao ar (ou num secador de poços ao longo de dois diâmetros perpendiculares e à lâminas a 37 ºC) e proceder à sua fixação à chama. volta do perímetro. Para amostras que não revelem Nesta fase o procedimento pode ser interrompido e células, ou cujo número seja reduzido, observar, pelo a hibridação continuada no dia seguinte. As lâminas menos, 40 campos do microscópio. devem ser armazenadas em local sem poeiras e seco, 7.3.2 — Procurar células fluorescentes brilhantes à temperatura ambiente. com a morfologia característica de R. solanacearum 7.2 — Hibridação: nos poços das lâminas de teste (ver sítio web http:// 7.2.1 — Desidratar as células num gradiente de con- forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). A centrações de etanol de 50 %, 80 % e 96 % durante intensidade de fluorescência deve ser equivalente ou 1 minuto cada. Secar as lâminas ao ar num porta-lâ- superior à da estirpe do controlo positivo. As células minas. com coloração incompleta ou com fluorescência fraca 7.2.2 — Preparar uma câmara de incubação húmi- não devem ser consideradas. da, cobrindo o fundo de uma caixa hermética com 7.3.3 — Caso se suspeite de qualquer contaminação, papel absorvente ou de filtro embebido em 1x «hyb- o teste deve ser repetido. Este pode ser o caso quan- mix» (apêndice n.º 7). Pré-incubar a caixa na estufa de do todas as lâminas de um lote revelem células posi- hibridação a 45 ºC durante, pelo menos, 10 minutos. tivas devido à contaminação do tampão ou se forem 7.2.3 — Juntar 10 μl de solução de hibridação encontradas células positivas (fora dos poços da lâmi- (apêndice n.º 7) a 8 poços (poços 1, 2, 4, 5, 6, 7, 9 e na) no revestimento da lâmina. 10; ver figura n.º 3) de cada lâmina, deixando vazios 7.3.4 — Há vários problemas inerentes à especifici- os dois poços centrais (3 e 8). dade do teste FISH. Em sedimentos de cones de hilo 7.2.4 — Cobrir os primeiros e os últimos 4 poços e de segmentos de caule da batateira, é provável a com lamelas (24 x 24 mm) sem retenção de ar. Colo- ocorrência de populações de células fluorescentes com car as lâminas na câmara húmida pré-aquecida e hi- morfologia atípica e reacções cruzadas de bactérias bridar durante 5 horas na estufa a 45 ºC, no escuro. saprófitas com dimensões e morfologia semelhantes às 7.2.5 — Preparar 3 copos contendo 1 l de água Milli de R. solanacearum, apesar de este fenómeno ser Q (grau molecular), 1 l de 1x «hybmix» (334 ml 3x menos frequente do que no teste IF. «hybmix» e 666 ml água Milli Q) e 1 l de 1/8x de 7.3.5 — Considerar unicamente as células fluores- «hybmix» (42 ml 3x «hybmix» e 958 ml água Milli centes de dimensões e morfologia típicas. Q). Pré-incubar cada um deles em banho-maria a 7.3.6 — Interpretação do resultado do teste FISH: 45 ºC. i) Obtêm-se resultados válidos para o teste FISH 7.2.6 — Retirar as lamelas das lâminas e colocar quando se observarem, com um filtro para FITC, cé- estas últimas no porta-lâminas. lulas brilhantes com fluorescência verde de dimensões 7.2.7 — Remover as sondas em excesso por incu- e morfologia típicas de R. solanacearum e, com o fil- bação durante 15 minutos no recipiente com 1x «hyb- tro para rodamina, células brilhantes com fluorescên- mix» a 45 ºC. cia vermelha em todos os controlos positivos, as quais 7.2.8 — Transferir o porta-lâminas para uma solu- deverão estar ausentes em todos os controlos negati- ção de lavagem com 1/8 de «hybmix» e incubar du- vos. Se forem detectadas células fluorescentes brilhan- rante mais 15 minutos. tes e com a morfologia característica, determinar o 7.2.9 — Mergulhar as lâminas brevemente em água número médio de células típicas por cada campo do Milli Q e colocá-las sobre papel de filtro. Remover o microscópio e calcular o número de células típicas por excesso de humidade cobrindo a superfície suavemen- ml de sedimento ressuspenso (apêndice n.º 4). As te com papel de filtro. Pipetar 5-10 μl de solução de amostras com, pelo menos, 5x 103 células típicas por montagem que evite uma rápida perda de fluorescên- ml de sedimento ressuspenso são consideradas como cia (por exemplo, Vectashield, Vecta Laboratories, CA, potencialmente contaminadas. A realização de outros USA ou equivalente) para cada poço e aplicar uma testes é obrigatória. As amostras com menos de 5x 103 lamela grande (24 x 60 mm) cobrindo toda a lâmina. células típicas por ml de sedimento ressuspenso são 7.3 — Leitura do teste FISH consideradas negativas; 7.3.1 — Observar imediatamente as lâminas com um ii) O teste FISH é negativo se, com um filtro para microscópio equipado para microscopia de epifluores- rodamina, não se observarem células brilhantes com cência, sob lente de imersão em óleo, a uma amplia- fluorescência vermelha e dimensões e morfologia típi- ção de 630 ou 1000 ×. Com um filtro indicado para cas de R. solanacearum, e sejam observadas células isotiocianato de fluoresceína (FITC), as células eubac- típicas brilhantes com fluorescência vermelha nas pre- terianas (incluindo a maior parte das células gram-ne- parações de controlo positivo. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4115 8 — Testes ELISA: 3) Colocar alíquotas de 100 μl em, pelo menos, dois Princípio: dos poços de uma microplaca (por exemplo Nunc- O teste ELISA só pode ser utilizado como teste Polysorp ou equivalente) e incubar durante 1 hora a opcional em complemento de testes IF, PCR ou FISH, 37 ºC ou durante a noite a uma temperatura de 4 ºC; devido à sensibilidade relativamente baixa deste teste. 4) Retirar os extractos dos poços. Lavar os poços Quando se utiliza o teste DAS ELISA, é obrigatório três vezes com PBS-Tween (apêndice n.º 4), deixando efectuar o enriquecimento e utilizar anticorpos mono- a última solução de lavagem dentro dos poços duran- clonais (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/ te, pelo menos, 5 minutos, irc/sanco/Home/main). Pode ser útil efectuar um enri- 5) Preparar uma diluição adequada de anticorpos quecimento das amostras antes de utilizar o teste ELI- contra R. solanacearum em tampão de bloqueio (apên- SA a fim de aumentar a sensibilidade deste teste, mas dice n.º 4). Para anticorpos comerciais validados, uti- esse enriquecimento pode ser infrutífero devido à con- lizar as diluições recomendadas (geralmente uma con- corrência de outros organismos presentes na amostra. centração duas vezes superior ao título); 6) Adicionar 100 μl a cada poço e incubar durante Nota. — Utilizar anticorpos validados para R. sola- 1 hora a 37 ºC; nacearum (ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Pu- 7) Retirar a solução de anticorpos dos poços e la- blic/irc/sanco/Home/main). Recomenda-se a determina- var como anteriormente (n.º 4); ção do título para cada novo lote de anticorpos. O 8) Preparar uma diluição adequada de conjugado título é definido como a diluição mais elevada para a anticorpo secundário — fosfatase alcalina em tampão qual se verifica uma reacção óptima ao testar uma de bloqueio. Adicionar 100 μl a cada poço e incubar suspensão contendo 105 a 106 células por ml de uma durante 1 hora a 37 ºC; estirpe homóloga de R. solanacearum e recorrendo a 9) Retirar o anticorpo conjugado dos poços e lavar conjugados de anticorpos secundários adequados, de como anteriormente (n.º 4); acordo com as recomendações do fabricante. Durante 10) Adicionar 100 μl de solução de substrato de os testes, os anticorpos devem ser utilizados em dilui- fosfatase alcalina (apêndice n.º 4) a cada poço. Incu- ções de trabalho próximas ou no título da formulação bar no escuro à temperatura ambiente e ler a absor- comercial. vância a 405 nm a intervalos regulares durante 90 Determinar o título dos anticorpos com uma suspen- minutos. são de 105 a 106 células por ml de uma estirpe homó- loga de R. solanacearum. b) DASI ELISA: Incluir como controlo negativo um extracto de amos- tra que tenha anteriormente sido testado com resulta- 1) Preparar uma diluição adequada de imunoglobu- do negativo para R. solanacearum e uma suspensão linas policlonais anti-R. solanacearum em tampão de de uma bactéria que não origine reacção cruzada em revestimento, pH 9,6 (apêndice n.º 4). Adicionar 200 μl tampão fosfato salino (PBS). a cada poço. Incubar a 37 ºC durante 4-5 horas ou a Como controlo positivo, utilizar alíquotas de extracto 4 ºC durante 16 horas; de amostra que tenha anteriormente sido testado com 2) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apên- resultado negativo, inoculadas com 103 a 104 células dice n.º 4); por ml de R. solanacearum Biovar 2 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857, ver Nota. — Adicionar 190 μl de extracto de amostra partes A e B do apêndice n.º 2). Para a comparação em, pelo menos, dois poços. Adicionar também con- dos resultados de cada placa, utilizar uma suspensão trolos positivos e negativos em dois poços de cada padrão de 105 a 106 células de R. solanacearum por placa. Incubar durante 16 horas a 4 ºC. ml em PBS. Assegurar-se de que os controlos positi- vos estão bem separados da(s) amostra(s) em estudo 3) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apên- na microplaca. dice n.º 4); Os materiais normalizados de controlo positivo e 4) Preparar uma diluição adequada de anticorpos negativo que podem ser utilizados neste teste são des- monoclonais específicos contra R. solanacearum em critos na parte A do apêndice n.º 3. PBS (apêndice n.º 4) que contenha também 0,5 % de Testar o material de controlo de forma idêntica à albumina de soro de bovino (BSA) e adicionar 190 μl da(s) amostra(s). a cada poço. Incubar a 37 ºC durante 2 horas; 5) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apên- Foram validados dois protocolos ELISA. dice n.º 4); 6) Preparar uma diluição adequada de imunoglobu- a) Teste ELISA indirecto (Robinson Smith et al., linas anti-rato conjugadas com fosfatase alcalina em 1995): PBS. Adicionar 190 μl a cada poço. Incubar a 37 ºC 1) Utilizar alíquotas de 100-200 μl de extracto de durante 2 horas; amostra. (O aquecimento a 100 ºC durante 4 minutos 7) Lavar os poços três vezes com PBS-Tween (apên- em banho-maria ou num bloco de aquecimento pode, dice n.º 4); nalguns casos, reduzir os resultados não específicos); 8) Preparar uma solução de substrato de fosfatase 2) Adicionar um volume igual de tampão de reves- alcalina que contenha 1 mg de fosfato de p-nitrofeni- timento 2 x (apêndice n.º 4) e agitar em vortex; lo por ml de tampão de substrato (apêndice n.º 4). 4116 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 Adicionar 200 μl a cada poço. Incubar no escuro à 9.2.2 — Inoculação por fenda. temperatura ambiente e ler a absorvância a 405 nm a Segurar a planta entre dois dedos, pipetar uma gota intervalos regulares durante 90 minutos. (cerca de 5-10 μl) do sedimento ressuspenso no cau- le, entre os cotilédones e a primeira folha. Interpretação do resultado do teste ELISA: Utilizando um escalpelo esterilizado, fazer uma fen- O teste ELISA é negativo se a média das leituras da em diagonal com 1,0 cm de comprimento e com da densidade óptica (DO) dos poços de amostras du- uma profundidade de cerca de 2/3 do diâmetro do plicadas for < 2x DO do poço de controlo negativo do caule, começando a incisão a partir da gota de sedi- extracto de amostra, desde que as DO dos controlos mento. positivos sejam todas superiores a 1,0 (após 90 minu- Selar o corte com vaselina esterilizada aplicada com tos de incubação com o substrato) e sejam superiores uma seringa. ao dobro da DO obtida para os extractos de amostras 9.3 — Inocular, através da mesma técnica, 5 plântu- negativas. las com uma suspensão aquosa de 105 a 106 células por O teste ELISA é positivo se a DO média dos po- ml preparada a partir de uma cultura de 48 horas de ços de amostras duplicadas for > 2x DO do poço de uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2, extracto de amostra negativa, desde que as DO de como controlo positivo, e com tampão de ressuspensão todos os poços de controlo negativo sejam < 2x as DO (apêndice n.º 4) como controlo negativo. Separar as dos poços de controlo positivo. plantas de controlo positivo e negativo das outras plan- Uma leitura ELISA negativa nos poços de controlo tas, a fim de evitar contaminações cruzadas. positivo indica que o teste não foi efectuado correcta- 9.4 — Deixar crescer as plantas em instalações de mente ou que ocorreram inibições. Uma leitura ELI- quarentena durante um período de até 4 semanas a uma SA positiva nos poços de controlo negativo indica que temperatura de 25-30 ºC e elevada humidade relativa, ocorreu contaminação cruzada ou uma ligação não regando adequadamente para evitar o alagamento ou específica de anticorpos. a murchidão por falta de água. Para evitar a contami- 9 — Bioensaio: nação, incubar as plantas de controlo positivo e as de controlo negativo em prateleiras claramente separadas Nota. — Um ensaio preliminar com este teste deve- numa estufa ou câmara de crescimento ou, caso exis- ria permitir a detecção reprodutível de 103 a 104 uni- tam limitações de espaço, garantir uma separação ri- dades formadoras de colónias de R. solanacearum por gorosa. Se as plantas relativas a amostras diferentes ml adicionadas a amostras de extractos para as quais se obtiveram anteriormente resultados negativos (para tiverem de ser incubadas perto umas das outras, sepa- a preparação, ver apêndice n.º 3). rá-las com as divisórias adequadas. Evitar contamina- ções cruzadas ao adubar, regar, inspeccionar ou ao Pode esperar-se a sensibilidade de detecção mais ele- proceder a outras manipulações. É essencial manter as vada quando se utiliza uma amostra de extracto recen- estufas ou as câmaras de crescimento isentas de pra- temente preparada e condições de crescimento óptimas. gas, visto que estas podem promover a transmissão da No entanto, o método pode ser aplicado com sucesso a bactéria entre amostras. extractos que tenham sido armazenados em glicerol a Observar o desenvolvimento de sintomas de murchi- uma temperatura compreendida entre –68 e –86 ºC. dão, epinastia, clorose e/ou nanismo. O protocolo seguinte tem por base Janse (1988): 9.5 — Fazer isolamentos a partir das plantas infec- 9.1 — Para cada amostra, utilizar 10 plantas de uma tadas (n.º 3 da secção II) e identificar culturas puras de cultivar susceptível de tomateiro (por exemplo «Mo- presumíveis colónias de R. solanacearum (parte B da neymaker» ou cultivar com susceptibilidade equivalen- secção VI). te, determinada pelo laboratório) no estádio de três 9.6 — Caso não se observem sintomas após 3 se- folhas verdadeiras. Para os pormenores de cultivo, ver manas, efectuar um teste IF, PCR ou de isolamento apêndice n.º 8. Em alternativa, utilizar beringelas (por numa amostra composta de secções de 1 cm do caule exemplo cultivar «Black Beauty» ou cultivares com de cada uma das plantas inoculadas com os extractos susceptibilidade equivalente), mas apenas plantas que das amostras, colhidas acima do local da inoculação. se encontrem no estádio fenológico de duas a três Se o teste for positivo, proceder à diluição em placas folhas, até que a terceira folha verdadeira esteja com- (n.º 4.1). pletamente expandida. Tem-se observado que os sin- 9.7 — Identificar culturas puras de presumíveis co- tomas são menos graves e se desenvolvem mais lenta- lónias de R. solanacearum (parte B da secção VI). mente na beringela. Recomenda-se, por conseguinte, a Interpretação dos resultados do bioensaio: utilização de plântulas de tomateiro, sempre que pos- Obtêm-se resultados válidos no bioensaio quando as sível. plantas do controlo positivo revelam sintomas típicos, 9.2 — Distribuir 100 μl de extracto de amostra pe- é possível isolar novamente bactérias a partir destas las plantas. plantas e não se observam sintomas nos controlos 9.2.1 — Inoculação por injecção. negativos. Inocular os caules das plantas imediatamente acima O bioensaio é negativo se as plantas inoculadas com dos cotilédones, utilizando uma seringa com uma agu- os extractos das amostras não estiverem infectadas por lha hipodérmica (não inferior a 23 G). Distribuir a R. solanacearum e se for detectada R. solanacearum amostra pelas plantas. nos controlos positivos. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4117 O bioensaio é positivo se as plantas inoculadas com 3.3 — Um resultado positivo no teste ELISA é al- os extractos das amostras estiverem infectadas por R. cançado se a leitura ELISA obtida para a cultura for, solanacearum. pelo menos, igual a metade da obtida para o controlo positivo. PARTE B 4 — Testes PCR: Testes de identificação 4.1 — Preparar uma suspensão com cerca de 106 células por ml em água esterilizada UPW. Identificar culturas puras de presumíveis isolados de 4.2 — Aquecer 100 μl da suspensão de células em R solanacearum, utilizando, pelo menos, dois dos se- tubos fechados num bloco de aquecimento ou em ba- guintes testes baseados em princípios biológicos dife- nho-maria em ebulição a 100 ºC durante 4 minutos. As rentes. amostras podem, então, ser armazenadas a uma tem- Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que peratura compreendida entre – 16 e –24 ºC até serem adequado, para cada teste realizado (ver apêndice necessárias. n.º 3). 4.3 — Aplicar os procedimentos PCR adequados 1 — Testes nutricionais e enzimáticos: para amplificar os fragmentos específicos de R. sola- Determinar as seguintes características fenotípicas, nacearum [por exemplo Seal et al. (1993), Pastrik e que estão universalmente presentes ou ausentes em R. Maiss (2000), Pastrik et al. (2002), Boudazin et al. solanacearum, de acordo com os métodos de Lelliott (1999), Opina et al. (1997), Weller et al. (1999)]. e Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001). 4.4 — É alcançada uma identificação positiva para Testes Resultado esperado R. solanacearum se os fragmentos de amplificação da PCR tiverem a mesma dimensão e os mesmos poli- Produção de pigmento fluorescente - morfismos dos fragmentos de restrição que a estirpe Grânulos de poli-ȕ-hidroxibutirato + de controlo positivo. Teste de oxidação/fermentação (O/F) O+F- 5 — Teste FISH: Produção da catalase + 5.1 — Preparar uma suspensão de cerca de 106 cé- Teste de oxidase de Kovac + lulas por ml em UPW. 5.2 — Aplicar o procedimento FISH (n.º 7 da Redução dos nitratos + parte A da secção VI) com, pelo menos, duas sondas Utilização de citrato + específicas para R. solanacearum (apêndice n.º 7). Crescimento a 40 ºC - 5.3 — Um resultado positivo no teste FISH é alcan- Crescimento em NaCl a 1 % + çado se a cultura apresentar as mesmas reacções do controlo positivo. Crescimento em NaCl a 2 % - 6 — Perfis de ácidos gordos (FAP): Produção de arginina di-hidrolase - 6.1 — Incubar o isolado em agar de soja e triptica- Liquefacção da gelatina - se (Oxoid) durante 48 horas a 28 ºC. Hidrólise do amido - 6.2 — Utilizar um procedimento FAP adequado Hidrólise da esculina - (Janse, 1991; Stead, 1992). 6.3 — Um resultado positivo no teste FAP é alcan- Produção de levana - çado se o perfil do presumível isolado for idêntico ao do controlo positivo. A presença de ácidos gordos 2 — Teste IF: característicos 14:0 3OH, 16:0 2OH, 16:1 2OH e 18:1 2.1 — Preparar uma suspensão com cerca de 106 2OH e a ausência de 16:0 3OH são altamente indica- células por ml em tampão IF (apêndice n.º 4). tivas de Ralstonia sp. 2.2 — Preparar uma série de diluições a 1:2 de um 7 — Métodos para caracterização da estirpe: anti-soro adequado (ver sítio web http://forum.europa. A caracterização da estirpe utilizando um dos mé- eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). todos seguintes é recomendada para cada novo caso 2.3 — Aplicar o procedimento de IF (n.º 5 da parte de isolamento de R. solanacearum. A da secção VI). Incluir estirpes de referência conhecidas, sempre que 2.4 — Um resultado positivo no teste IF é alcança- adequado, para cada teste realizado (ver apêndice n.º 3). do se o título IF para a cultura em estudo for equiva- 7.1 — Determinação do biovar: lente ao do controlo positivo. A espécie R. solanacearum encontra-se dividida em 3 — Teste ELISA: Biovares com base na sua capacidade em utilizar e/ou oxidar três dissacáridos e três álcoois de hexoses Nota. — Se se realizarem apenas dois testes de iden- (Hayward, 1964 e Hayward et al., 1990). O meio de tificação, não deve utilizar-se outro teste serológico crescimento para o teste do Biovar é descrito no apên- como complemento deste teste. dice n.º 2. O teste pode ser realizado com sucesso mediante a inoculação por picada dos meios de cres- 3.1 — Preparar uma suspensão com cerca de 108 cimento com culturas puras de isolados de R. solana- células por ml em 1X PBS (apêndice n.º 4). cearum e incubação a 28 ºC. Se os meios forem dis- 3.2 — Utilizar um teste ELISA adequado com um tribuídos em placas estéreis de cultura de 96 poços anticorpo monoclonal específico para R. solanacearum. (200 μl por poço) pode observar-se uma mudança de 4118 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 cor, de verde azeitona para amarelo, passadas 72 ho- ciar estirpes pertencentes à Divisão 1 (Biovares 3, 4 e ras, o que indica um resultado positivo. 5) e Divisão 2 (Biovares 1, 2A e 2T) de R. solanace- arum, como definidas inicialmente pela análise RFLP Biovar (Cook et al., 1989) e a sequenciação de 16S rADN (Taghavi et al., 1996). Utilização de: 1 2 3 4 5 Maltose - + + - + PARTE C Lactose - + + - + Teste de confirmação D (+) Celobiose - + + - + O teste de patogenicidade tem de ser efectuado Manitol - - + + + como confirmação final do diagnóstico de R. solana- Sorbitol - - + + - cearum e para avaliar a virulência dos isolados iden- Dulcitol - - + + - tificados como R. solanacearum: 1) Preparar um inóculo de aproximadamente 106 Testes adicionais diferenciam o Biovar 2 em subfe- células por ml de uma cultura com 24-48 horas do iso- nótipos. lado a ser testado e de uma estirpe de R. solanacearum adequada para controlo positivo (por exemplo NCPPB Biovar 2A Biovar 2T Biovar 2A 4156 = PD 2762 = CFBP 3857; ver apêndice n.º 3); (Encontrada (Encontrada (Repartição no Chile e na nas áreas 2) Inocular 5-10 plântulas de tomateiro ou beringe- mundial) la susceptíveis no estádio de três folhas verdadeiras Colômbia) tropicais) Utilização de Trealose - + + (ver n.º 9 da parte A da secção VI); 3) Incubar durante, no máximo, 2 semanas a uma Utilização de meso- + - + Inositol temperatura de 25-28 ºC e elevada humidade relativa, regando adequadamente para evitar o alagamento ou Utilização de D-Ribose - - + a seca. Com culturas puras deve observar-se a mur- Actividade pectolítica baixa baixa alta chidão típica no período de 14 dias. Se no final deste * ( ) Ver Lelliott e Stead (1987). período não se observarem quaisquer sintomas, não se pode confirmar que a cultura seja uma forma patogé- 7.2 — «Genomic fingerprinting»: nica de R. Solanacearum; A diferenciação molecular das estirpes do comple- 4) Observar o desenvolvimento de sintomas de xo R. solanacearum pode ser efectuada através de murchidão e ou epinastia, clorose e nanismo; várias técnicas, entre as quais são de referir: 5) Efectuar um isolamento a partir das plantas sin- 7.2.1 — Análise do polimorfismo dos fragmentos de tomáticas, retirando-lhes uma secção de cerca de 2 restrição (RFLP) (Cook et al., 1989). cm de caule acima do ponto de inoculação. Fragmen- 7.2.2 — PCR de sequências repetitivas utilizando tá-las e suspendê-las num pequeno volume de água iniciadores REP, BOX e ERIC (Louws et al., 1995; destilada esterilizada ou de tampão fosfato 50 mM Smith et al., 1995). (apêndice n.º 4). Isolar a partir de diluições apropri- 7.2.3 — Análise do polimorfismo dos fragmentos adas da suspensão por espalhamento ou reticulado amplificados (AFLP) (Van der Wolf et al., 1998). num meio adequado, de preferência selectivo (apên- 7.3 — Métodos PCR: dice n.º 2), incubar durante 48-72 horas a 28 ºC e Podem utilizar-se iniciadores específicos para PCR observar a formação de colónias típicas de R. sola- (Pastrik et al., 2002; ver apêndice n.º 6) para diferen- nacearum. APÊNDICE N.º 1 Laboratórios envolvidos na validação e optimização de protocolos Laboratório (1) Localização País Agentur für Gesundheit und Ernährungssicherheit Viena e Linz Áustria Departement Gewasbescherming Merelbeke Bélgica Plantedirektoratet Lyngby Dinamarca Central Science Laboratory York Inglaterra Scottish Agricultural Science Agency Edimburgo Escócia Laboratoire National de la Protection des Végétaux - Unité de Bactériologie Angers França Laboratoire National de la Protection des Végétaux - Station de Quarantaine de la Pomme de Terre Le Rheu França Biologische Bundesanstalt Kleinmachnow Alemanha Pflanzenschutzamt Hannover Hannover Alemanha State Laboratory Dublin Irlanda Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4119 Laboratório (1) Localização País Dipartimento di Scienze e Tecnologie Agroambientali Bolonha Itália Regione Veneto Unità Periferica per i Servizi Fitosanitari Verona Itália Nederlandse Algemene Keuringsdienst Emmeloord Países Baixos Plantenziektenkundige Dienst Wageningen Países Baixos Direcção-Geral de Protecção das Culturas Lisboa Portugal Centro de Diagnostico de Aldearrubia Salamanca Espanha Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias Valência Espanha Swedish University of Agricultural Sciences Uppsala Suécia (*) Cientistas de contacto: ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main APÊNDICE N.º 2 b) Meios de crescimento selectivo validados: Meios para isolamento e cultura de R. solanacearum Meio SMSA (Englebrecht, 1994 modificado por a) Meio geral de crescimento: Elphinstone et al., 1996) Agar nutritivo (NA) Meio basal Casaminoácidos (Difco) — 1,0 g Agar nutritivo (Difco) — 23,0 g Bacto-Peptona (Difco) — 10,0 g Água destilada — 1,0 l Glicerol — 5,0 ml Bacto-Agar (Difco), ver Nota 2. — 15,0 g Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave Água destilada — 1,0 l a 121 ºC durante 15 minutos. Agar com extracto de levedura, peptona e glucose (YPGA) Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave a 121° C durante 15 minutos. Extracto de levedura (Difco) — 5,0 g Arrefecer até 50° C e adicionar o volume necessá- Bacto-Peptona (Difco) — 5,0 g rio de soluções aquosas concentradas, esterilizadas por D(+)glucose mono-hidratada — 10,0 g filtração, dos seguintes ingredientes para obter as con- Bacto-Agar (Difco) — 15,0 g centrações finais especificadas: Água destilada — 1,0 l Violeta cristal (Sigma C-0775) — 5 mg por l Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave Sulfato de polimixina B (Sigma P-1004) — 600000 U a 121 ºC durante 15 minutos. (aproximadamente 100 mg) por l Bacitracina (Sigma B-0125) — 1250 U (aproxima- Agar de sacarose e peptona (SPA) damente 25 mg) por l Sacarose — 20,0 g Cloranfenicol (Sigma C-3175) — 5 mg por l Bacto-Peptona (Difco) — 5,0 g Penicilina-G (Sigma P-3032) — 825 U (aproxima- K2HPO4 — 0,5 g damente 0,5 mg) por l MgSO4.7H2O — 0,25 g Cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio (Sigma T-8877) — Bacto-Agar (Difco) — 15,0 g 50 mg por l Água destilada — 1,0 l pH 7,2-7,4 Nota. — A utilização de reagentes diferentes dos acima especificados pode afectar o crescimento de R. Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave solanacearum. a 121 ºC durante 15 minutos. Pode utilizar-se agar Oxoid #1 em vez de Bacto- agar (Difco). Neste caso, o crescimento de R. solana- Meio de tetrazólio de Kelman cearum será mais lento, embora o crescimento dos Casaminoácidos (Difco) — 1,0 g saprófitas competidores possa também ser reduzido. A Bacto-Peptona (Difco) — 10,0 g formação de colónias típicas de R. solanacearum pode Dextrose — 5,0 g demorar mais 1-2 dias e a coloração vermelha pode Bacto-Agar (Difco) — 15,0 g ser mais clara e mais difusa do que em Bacto-agar. Água destilada — 1,0 l O aumento da concentração de bacitracina para 2500 U por l pode reduzir as populações de bactérias com- Dissolver os ingredientes e esterilizar em autoclave petidoras sem afectar o crescimento de R. solanacea- a 121 ºC durante 15 minutos. rum. Arrefecer até 50 ºC e adicionar o volume necessá- rio de solução de cloreto de 2,3,5-trifenil-tetrazólio Armazenar os meios e as soluções concentradas de (Sigma), esterilizada por filtração, para obter uma con- antibióticos a 4 ºC, no escuro, e utilizar no prazo de centração final de 50 mg por l. um mês. 4120 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 As placas devem estar livres de condensação super- Esterilizar em autoclave a 121° C durante 15 minu- ficial antes da utilização. tos e arrefecer até 50 ºC Evitar a secagem excessiva das placas. Adicionar soluções concentradas de antibióticos Após a preparação de cada novo lote de meio deve como para o meio líquido SMSA. efectuar-se um controlo de qualidade mediante o es- palhamento de uma suspensão de uma cultura de re- APÊNDICE N.º 3 ferência de R. solanacearum (ver apêndice n.º 3), ob- Parte A servando a formação de colónias típicas após incubação a 28 ºC durante 2-5 dias. Material de controlo normalizado disponível no mercado c) Meios de enriquecimento validados: a) Isolados bacterianos: Meio líquido SMSA (Elphinstone et al., 1996) Recomenda-se a utilização dos seguintes isolados Preparar de forma idêntica à do meio selectivo bacterianos como material de referência normalizado, SMSA contendo agar, mas excluindo o Bacto-agar e quer como controlos positivos (quadro I) quer durante o cloreto de 2,3,5-trifenil tetrazólio. a optimização de testes para evitar reacções cruzadas (quadro II). Todas as estirpes são comercializadas por: Meio líquido de Wilbrink modificado (Caruso et al., 1) National Collection of Plant Pathogenic Bacteria 2002) (NCPPB), Central Science Laboratory, York, Reino Sacarose — 10g Unido; Proteose peptona — 5 g 2) Culture Collection of the Plant Protection Servi- K2HPO4 — 0,5g ce (PD), Wageningen, Países Baixos; MgSO4 — 0,25g 3) Collection Française de Bactéries Phytopathogè- NaNO3 — 0,25g nes (CFBP), INRA Station Phytobactériologie, Angers, Água destilada — 1 l França. QUADRO I Tabela de referência SMT de isolados de R. solanacearum Código SMT País Outros códigos Biovar NCPPB # de origem NCPPB 4153 6 CFBP 4582, Pr 3020, EURS11 Egipto 2 NCPPB 4154 10 CFBP 4585, 550, EURS21 Turquia 2 NCPPB 3857 12 CFBP 4587, Pr 1140, EURS26 Inglaterra 2 NCPPB 1584 23 CFBP 4598, EURS49 Chipre 2 NCPPB 2505 24 CFBP 4599, EURS50 Suécia 2 NCPPB 4155 26 CFBP 4601, 502, EURS55 Bélgica 2 NCPPB 4156 (*) 71 (*) PD 2762, CFBP 3857 Países Baixos 2 NCPPB 4157 66 LNPV 15.59 França 2 NCPPB 4158 39 CFBP 4608, Port 448, EURS80 Portugal 2 NCPPB 4160 69 IVIA-1632-2 Espanha 2 NCPPB 4161 76 B3B Alemanha 2 NCPPB 325 41 CFBP 2047, KEL60-1, R842 EUA 1 NCPPB 3967 42 CFBP 4610, R285, GONg7 Costa Rica 1 NCPPB 4028 43 CFBP 4611, R303/571, CIP310, SEQ205 Colômbia 2 NCPPB 3985 44 CFBP 4612, R578, CIP312 Peru 2T NCPPB 3989 45 CFBP 4613, R568, CIP226 Brasil 2T NCPPB 3996 46 CFBP 3928, R276/355, CIP72, SEQ225 Peru 3 NCPPB 3997 47 CFBP 4614, R280/363, CIP49, HAY0131a Austrália 3 NCPPB 4029 48 CFBP 4615, R297/349, CIP121, CMIb2861 Sri Lanca 4 NCPPB 4005 49 CFBP 4616, R470 Filipinas 4 NCPPB 4011 50 CFBP 4617, R288, HEmps2 China 5 (*) Utilizar como estirpe normalizada de R. solanacearum Biovar 2 (raça 3). Nota. — A autenticidade das estirpes acima indicadas só pode ser garantida se estas forem obtidas a partir de uma colecção de culturas autênticas. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4121 QUADRO II Tabela de referência SMT de bactérias serológica ou geneticamente relacionadas para utilização na optimização de testes de detecção Código NCPPB SMT # Outro código Identificação NCPPB 4162 51 CFBP 1954 Bacillus polymyxa (1) NCPPB 4163 52 CFBP 1538 Pseudomonas marginalis pv. marginalis (1) NCPPB 4164 – CFBP 2227 Burkholderia cepacia (2) NCPPB 4165 – CFBP 2459 Ralstonia pickettii (2) NCPPB 4166 58 CFBP 3567 CSL Pr1150 Ralstonia pickettii (1) NCPPB 4167 60 CFBP 4618 PD 2778 Ralstonia sp. (1) NCPPB 127 53 CFBP 3575 Burkholderia andropogonis (1) NCPPB 353 54 CFBP 3572 Burkholderia caryophylli (1) NCPPB 945 55 CFBP 3569 Burkholderia cepacia (1) NCPPB 3708 56 CFBP 3574 Burkholderia glumae (1) NCPPB 3590 57 CFBP 3573 Burkholderia plantarii (1) PPB 3726 59 CFBP 3568 Banana Blood Disease Bacterium (1) (2) (3) NCPPB 4168 61 CFBP 4619 IPO S339 Enterobacter sp. (1) NCPPB 4169 62 IPO 1695 Enterobacter sp. (1) NCPPB 4170 63 CFBP 4621 IPO S306 Ochrobactrum anthropi (1) (2) NCPPB 4171 64 CFBP 4622 IPO 1693 Curtobacterium sp. (1) (2) NCPPB 4172 65 IPO 1696a Pseudomonas sp. (1) NCPPB 4173 – PD 2318 Aureobacterium sp. (2) NCPPB 4174 81 IVIA 1844,06 Flavobacterium sp. (1) (2) (1) Estirpe que pode produzir uma reacção cruzada em testes serológicos (IF e/ou ELISA) com anti-soros policlonais. (2) Estirpe a partir da qual, nalguns laboratórios, o produto da PCR pode ser amplificado com um tamanho idêntico ao esperado utilizando iniciadores específicos OLI-1 e Y- 2 (ver apêndice n.º 6). (3) Susceptível de provocar reacções cruzadas na maior parte dos testes, mas apenas é conhecida a sua ocorrência em bananeira na Indonésia. b) Material de controlo normalizado disponível no raça 3 (por exemplo estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 mercado: = CFBP 3857) em tampão fosfato 10 mM, de modo a obter uma concentração de, aproximadamente, 2x108 O material de controlo seguidamente indicado está ufc por ml. Esta é obtida, normalmente, com uma disponível na colecção de culturas NCPPB. suspensão ligeiramente turva equivalente a uma densi- Sedimento liofilizado de extracto de batata prove- dade óptica de 0,15 a 600 nm. niente de 200 tubérculos de batateira sãos como con- Remover os cones dos hilos de 200 tubérculos co- trolo negativo para todos os testes. lhidos de uma variedade de epiderme branca, isenta de Sedimento liofilizado de extracto de batata prove- R. solanacearum. niente de 200 tubérculos de batateira sãos com 103 a Processar os hilos como habitualmente e ressuspen- 104 e 104 a 106 células de R. solanacearum Biovar 2 der o sedimento em 10 ml. (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = CFBP 3857) como Preparar 10 microtubos esterilizados de 1,5 ml com controlo positivo para testes serológicos e PCR. Visto 900 μl de sedimento ressuspenso. que a viabilidade das células é afectada durante a lio- Transferir 100 μl da suspensão de R. solanacearum filização, estes controlos não são adequados como para o primeiro microtubo. Agitar em vortex. controlos normalizados para testes de isolamento ou Utilizar os cinco microtubos seguintes para efectu- bioensaio. ar uma série de cinco diluições decimais. Suspensões fixadas em formalina de R. solanacea- Os seis microtubos contaminados serão utilizados rum Biovar 2 (estirpe NCPPB 4156 = PD 2762 = como controlos positivos. Os quatro microtubos não CFBP 3857) com 106 células por ml como controlos contaminados serão utilizados como controlos negati- positivos para testes serológicos. vos. Rotular os microtubos em conformidade. PARTE B Preparar alíquotas de 100 μl em microtubos esterili- zados de 1,5 ml, obtendo assim nove réplicas de cada Preparação de controlos positivos e negativos para os amostra de controlo. Armazenar a uma temperatura testes essenciais de rastreio PCR/IF e FISH compreendida entre – 16 e – 24 ºC até à sua utilização. Preparar uma suspensão a partir do crescimento de A presença e a quantificação de R. solanacearum uma cultura com 48 horas em meio basal SMSA de nas amostras de controlo devem ser primeiro confir- uma estirpe virulenta de R. solanacearum Biovar 2/ madas por IF. 4122 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 Para o teste PCR efectuar a extracção de ADN das Na2HPO4.12H2O — 2,7 g amostras de controlo positivo e negativo para cada NaH2PO4.2H2O — 0,4 g série de amostras a testar. NaCl — 8,0 g Para os testes IF e FISH efectuar ensaios nas amos- Água destilada — 1,0 l tras de controlo positivo e negativo para cada série de amostras a testar. Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- Para os testes IF, FISH e PCR, deve detectar-se R. zar em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. solanacearum, pelo menos, nas amostras de controlo positivo com 106 e 104 células por ml e não deve ser 2.2 — Tampão IF-Tween: detectada em nenhum controlo negativo. Este tampão é utilizado para lavagem das lâminas. APÊNDICE N.º 4 Adicionar 0,1 % de Tween 20 ao tampão IF. Tampões para a realização dos testes 2.3 — Tampão fosfato com glicerol, pH 7,6: Geral: Este tampão é utilizado como líquido de montagem Os tampões esterilizados não abertos podem ser nos poços das lâminas de IF para aumentar a fluores- armazenados durante 1 ano. cência. 1 — Tampões para extracção: Na2HPO4.12H2O — 3,2 g 1.1 — Tampão de extracção (tampão fosfato 50 mM, NaH2PO4.2H2O — 0,15 g pH 7,0): Glicerol — 50 ml Este tampão é utilizado para a extracção da bactéria Água destilada — 100 ml dos tecidos vegetais por homogeneização ou agitação. Estão disponíveis no mercado soluções de monta- Na2HPO4 (anidro) — 4,26 g gem para evitar a rápida perda de fluorescência, como KH2PO4 — 2,72 g sejam, por exemplo, Vectashield® (Vector Laborato- Água destilada — 1,00 l ries) ou Citifluor® (Leica). Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- 3 — Tampões para o teste ELISA indirecto: zar em autoclave a 121° C durante 15 minutos. 3.1 — Tampão de revestimento de dupla concentra- Os seguintes componentes adicionais podem também ção, pH 9,6: ser úteis: Na2CO3 — 6,36 g NaHCO3 — 11,72 g Quantidade Finalidade (por l) Água destilada — 1,00 l Flocos de Lubrol Antifloculante 0,5 g Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- Antiespuma DC silicone Antiespumante 1,0 ml zar em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. Pirofosfato tetrassódico Antioxidante 1,0 g Pode ser acrescentado sulfito de sódio (0,2 %) como Polivinilpirrolidona-40 000 Complexante de 50 g antioxidante, se for necessário para evitar a acumula- (PVP-40) inibidores da PCR ção de compostos aromáticos oxidados. (*) Para utilização com o método de extracção de homogeneização. 3.2 — Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,4: 1.2 — Tampão de ressuspensão (tampão fosfato 10 NaCl — 80,0 g mM, pH 7,2): KH2PO4 — 2,0 g Na2HPO4.12H2O — 29,0 g Este tampão é utilizado para a ressuspensão e di- KCl — 2,0 g luição dos extractos dos hilos do tubérculo da batatei- Água destilada — 1,0 l ra após a sua concentração por centrifugação. 3.3 — PBS-Tween: Na2HPO4.12H2O — 2,7 g NaH2PO4.2H2O — 0,4 g PBS 10x — 100 ml Água destilada — 1,0 l Tween 20 a 10 % — 5 ml Água destilada — 895 ml Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- zar em autoclave a 121° C durante 15 minutos. 3.4 — Tampão de bloqueio (anticorpo) - deve ser preparado na altura da utilização: 2 — Tampões para o teste IF: PBS 10x — 10,0 ml 2.1 — Tampão IF (tampão fosfato salino (PBS) 10 Polivinilpirrolidona-44000 (PVP-44) — 2,0 g mM, pH 7,2): Tween 20 a 10 % — 0,5 ml Este tampão é utilizado para a diluição dos anticor- Leite em pó — 0,5 g pos. Água destilada — Perfazer 100 ml Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4123 3.5 — Solução de substrato de fosfatase alcalina, pH 9,8: N = C x 1000/y x F Em que: Dietanolamina — 97 ml y = volume de sedimento ressuspenso em cada poço, e Água destilada — 800 ml F = factor de diluição do sedimento ressuspenso Misturar e acertar a pH 9,8 com HCl concentrado. APÊNDICE N.º 6 Perfazer o volume até 1l com água destilada. Juntar 0,2 g de MgCl2. Protocolos e reagentes validados para PCR Dissolver duas pastilhas de 5 mg cada de substrato de Nota. — Os testes preliminares deveriam permitir a fosfatase alcalina (Sigma) por cada 15 ml de solução. detecção reprodutível de 103 a 104 células de R. sola- nacearum por ml de extracto de amostra. 4 — Tampões para o teste DASI ELISA: Os testes preliminares não deveriam ainda revelar 4.1 — Tampão de revestimento, pH 9,6: nenhum resultado falso positivo com um painel de Na2CO3 — 1,59 g estirpes bacterianas seleccionadas (ver apêndice n.º 3). NaHCO3 — 2,93 g Água destilada — 1000 ml 1 — Protocolo PCR de Seal et al. (1993): 1.1 — Iniciadores: Dissolver os ingredientes e verificar o pH 9,6. Iniciador directo OLI-1 — 5’-GGG GGT AGC TTG CTA CCT GCC-3’ 4.2 — Tampão fosfato salino (PBS) 10x, pH 7,2-7,4: Iniciador inverso Y-2 — 5’-CCC ACT GCT GCC NaCl — 80,0 g TCC CGT AGG AGT-3’ NaH2PO4.2 H2O — 4,0 g Na2HPO4.12H2O — 27,0 g Tamanho esperado do fragmento amplificado do Água destilada — 1000 ml ADN-alvo de R. solanacearum = 288 bp. 1.2 — Mistura de reacção da PCR: 4.3 — PBS-Tween: 1.3 — Condições de reacção da PCR: PBS 10x — 50 ml Reagentes Volume por Concentração reacção final Tween 20 a 10 % — 5 ml Água destilada — 950 ml UPW esterilizada 17,65 μl * Tampão PCR ( ) 10x (MgCl2 15 mM) 2,5 μl 1x (MgCl2 4.4 — Tampão de substrato, pH 9,8: 1,5 mM) Dietanolamina — 100 ml Mistura dNTP (20 mM) 0,25 μl 0,2 mM Água destilada — 900 ml Iniciador OLI-1 (20 μM) 1,25 μl 1μM Iniciador Y-2 (20 μM) 1,25 μl 1μM Misturar e acertar a pH 9,8 com HCl concentrado. Taq Polimerase (5U/μl) ( ) * 0,1 μl 0,5 U Volume da amostra 0,2 μl APÊNDICE N.º 5 Volume total: 25,0 μl Determinação do nível de contaminação * em testes IF e FISH ( ) O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL. 1 — Determinar o número médio de células fluores- centes típicas por campo de observação (c). Correr o seguinte programa: 2 — Calcular o número de células fluorescentes tí- 1 ciclo de: picas por poço de lâmina de microscópio (C). i) 2 minutos a 96 ºC (desnaturação do ADN-alvo) C = c × S/s Em que: 35 ciclos de: S = área da superfície de cada poço da lâmina ii) 20 segundos a 94 ºC (desnaturação do ADN-alvo) multiteste, e iii) 20 segundos a 68 ºC (emparelhamento dos ini- s = área da superfície do campo da objectiva ciadores) iv) 30 segundos a 72 ºC (extensão da cópia) s = ði2/4G2K2 Em que: 1 ciclo de: i = coeficiente de campo (varia entre 8 e 24, de- v) 10 minutos a 72 ºC (extensão final) pendendo do tipo de ocular) vi) Manter a uma temperatura de 4 ºC K = coeficiente do tubo (1 ou 1,25) G = ampliação da objectiva (l00x, 40x, etc.) Nota. — Este programa foi optimizado para utiliza- ção com um termociclador Perkin Elmer 9600. Para a 3 — Calcular o número de células fluorescentes tí- utilização com outros modelos pode ser necessária a picas por ml de sedimento ressuspenso (N). alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv). 4124 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 1.4 — Análise de restrição enzimática do fragmen- restrição obtidos de um fragmento específico de R. sola- to amplificado: nacearum têm tamanhos de 457 bp e 96 bp. Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN 3 — Protocolo PCR Multiplex com controlo inter- de R. solanacearum produzem um polimorfismo dos no (Pastrik et al., 2002): fragmentos de restrição característico com a enzima 3.1 — Iniciadores: Ava II após incubação a 37 ºC. 2 — Protocolo PCR de Pastrik e Maiss (2000): Iniciador directo RS-1-F — 5’-ACT AAC GAA 2.1 — Iniciadores: GCA GAG ATG CAT TA-3’ Iniciador inverso RS-1-R — 5’-CCC AGT CAC Iniciador directo Ps-1 — 5’-AGT CGA ACG GCA GGC AGA GAC T-3’ GCG GGG G-3 Iniciador directo NS-5-F — 5’-AAC TTA AAG Iniciador inverso Ps-2 — 5’-GGG GAT TTC ACA GAA TTG ACG GAA G-3’ TCG GTC TTG CA-3’ Iniciador inverso NS-6-R — 5’-GCA TCA CAG ACC TGT TAT TGC CTC-3’ Tamanho esperado do fragmento amplificado de ADN-alvo de R. solanacearum = 553 bp. Tamanho esperado do fragmento amplificado de 2.2 — Mistura de reacção da PCR: ADN-alvo de R. solanacearum = 718 bp (conjunto iniciador RS). Volume por Concentração Reagentes reacção final Tamanho esperado do fragmento amplificado do controlo interno da PCR de 18S rARN = 310 bp (con- UPW esterilizada 16,025 μl junto iniciador NS). Tampão PCR (*) 10x 2,5 μl 1x (MgCl2 3.2 — Mistura de reacção da PCR: 1,5 mM) BSA (fracçãoV) (10 %) 0,25 μl 0,1 % Volume por Concentração Reagentes reacção final Mistura dNTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM UPW esterilizada 12,625 μl Iniciador Ps-1 (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM Tampão PCR (1) 10x (MgCl2 15 2,5 μl 1x (MgCl2 Iniciador Ps-2 (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM mM) 1,5 mM) Taq Polimerase (5U/μl) (*) 0,1 μl 0,5 U BSA (fracção V) (10 %) 0,25 μl 0,1 % Volume da amostra 5,0 μl Mistura d-NTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM Volume total: 25,0 μl Iniciador RS-1-F (10 μM) 2,0 μl 0,8 μM * ( ) O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) Iniciador RS-1-R (10 μM) 2,0 μl 0,8 μM e Gibco BRL. Iniciador NS-5-F (10 μM) (2) 0,15 μl 0,06 μM Nota: Originalmente optimizado para termociclador MJ Research PTC 200 com Taq Polymerase da Gibco. Pode também utilizar-se AmpliTaq e tampão Perkin Iniciador NS-6-R (10 μM) (2) 0,15 μl 0,06 μM Elmer, com as mesmas concentrações. Taq polimerase (5U/μl) (1) 0,2 μl 1,0 U 2.3 — Condições de reacção da PCR: Volume da amostra 5,0 μl Correr o seguinte programa: Volume total: 25,0 μl 1 ciclo de: (1) O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer (AmpliTaq) e Gibco BRL. i) 5 minutos a 95 ºC (desnaturação do ADN-alvo) (2) A concentração de iniciadores NS-5-F e NS-6-R foi optimizada para a extracção da bactéria a partir dos cones dos hilos da batateira, utilizando o método de homogeneização bem como o de purificação do ADN de acordo com 35 ciclos de: Pastrik (2000) (ver n.º 6.1 da parte A da secção VI). Será necessária a re- optimização das concentrações do reagente se se utilizar a extracção por agitação ii) 30 segundos a 95 ºC (desnaturação do ADN-alvo) ou outros métodos de isolamento do ADN. iii) 30 segundos a 68 ºC (emparelhamento dos ini- ciadores) 3.3 — Condições de reacção da PCR: iv) 45 segundos a 72 ºC (extensão da cópia) Correr o seguinte programa: 1 ciclo de: 1 ciclo de: i) 5 minutos a 95 ºC (desnaturação do ADN-alvo) v) 5 minutos a 72 ºC (extensão final) vi) Manter a uma temperatura de 4 ºC 35 ciclos de: Nota. — Este programa foi optimizado para utiliza- ii) 30 segundos a 95 ºC (desnaturação do ADN-alvo) ção com um termociclador MJ Research PTC 200. Para iii) 30 segundos a 58 ºC (emparelhamento dos ini- a utilização com outros modelos pode ser necessária a ciadores) alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv). iv) 45 segundos a 72 ºC (extensão da cópia) 2.4 — Análise de restrição enzimática do fragmen- 1 ciclo de: to amplificado: v) 5 minutos a 72 ºC (extensão final) Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN de vi) Manter a uma temperatura de 4 ºC R. solanacearum produzem um polimorfismo do fragmen- to de restrição característico com a enzima Taq I após Nota. — Este programa foi optimizado para utiliza- incubação a 65 ºC durante 30 minutos. Os fragmentos de ção com um termociclador MJ Research PTC 200. Para Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4125 a utilização com outros modelos pode ser necessária a 4.3 — Condições de reacção da PCR: alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv). Correr o seguinte programa para as reacções espe- cíficas dos Biovares 1/2 e 3/4/5: 3.4 — Análise de restrição enzimática do fragmen- 1 ciclo de: to amplificado: Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN i) 5 minutos a 95 ºC (desnaturação do ADN-alvo) de R. solanacearum produzem um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição característico 35 ciclos de: com a enzima Bsm I ou um isosquizómero (e.g. Mva ii) 30 segundos a 95 ºC (desnaturação do ADN-alvo) 1269 I) após incubação a 65 ºC durante 30 minutos. iii) 30 segundos a 58 ºC (emparelhamento dos ini- 4 — Protocolo PCR específico para os Biovares de ciadores) R. solanacearum (Pastrik et al, 2001): iv) 45 segundos a 72 ºC (extensão da cópia) 4.1 — Iniciadores: Iniciador directo Rs-1-F — 5’-ACT AAC GAA GCA 1 ciclo de: GAG ATG CAT TA-3’ Iniciador inverso Rs-1-R — 5’-CCC AGT CAC v) 5 minutos a 72 ºC (extensão final) GGC AGA GAC T-3’ vi) Manter a uma temperatura de 4 ºC Iniciador inverso Rs-3-R — 5’-TTC ACG GCA AGA TCG CTC-3’ Nota. — Este programa foi optimizado para utiliza- ção com um termociclador MJ Research PTC 200. Para Tamanho esperado do fragmento amplificado de a utilização com outros modelos pode ser necessária a ADN-alvo de R. solanacearum: alteração da duração das fases dos ciclos ii), iii) e iv). Com Rs-1-F/Rs-1-R = 718 bp; 4.4 — Análise de restrição enzimática do fragmen- Com Rs-1-F/Rs-3-R = 716 bp. to amplificado: Os produtos da PCR amplificados a partir de ADN 4.2 — Mistura de reacção da PCR: de R. solanacearum utilizando os iniciadores Rs-1-F e a) PCR específica para os Biovares 1 e 2: Rs-1-R produzem um polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição característico com a enzima Bsm Reagentes Volume por Concentração I ou um isosquizómero (por exemplo Mva 1269 I) após reacção final incubação a 65 ºC durante 30 minutos. Os produtos da UPW esterilizada 12,925 μl PCR amplificados a partir de ADN de R. solanacea- Tampão PCR (*) 10x 2,5 μl 1x (MgCl2 rum utilizando os iniciadores Rs-1-F e Rs-3-R não 1,5 mM) apresentam locais de restrição. BSA (fracção V) (10 %) 0,25 μl 0,1 % 5 — Preparação do tampão de carregamento: 5.1 — Azul de bromofenol (solução concentrada a 10 %): Mistura d-NTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM Iniciador Rs-1-F (10 μM) 2 μl 0,8 μM Azul de bromofenol — 5 g Água destilada (bidest) — 50 ml Iniciador Rs-1-R (10 μM) 2 μl 0,8 μM * Taq polimerase (5U/μl) ( ) 0,2 μl 1U 5.2 — Tampão de carregamento: Volume da amostra 5,0 μl Glicerol (86 %) — 3,5 ml Volume total: 25,0 μl Azul de bromofenol (5.1) — 300 μl (*) O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer Água destilada (bidest) — 6,2 ml (AmpliTaq) e Gibco BRL. 6 — Tampão de tris acetato EDTA (TAE) 10X, pH 8,0: b) PCR específica para os Biovares 3, 4 e 5: Tampão tris — 48,40 g Volume por Concentração Ácido acético glacial — 11,42 ml Reagentes reacção final EDTA (sal dissódico) — 3,72 g Água destilada — 1,00 l UPW esterilizada 14,925 μl * Tampão PCR ( ) 10x 2,5 μl 1x (MgCl2 Diluir até 1x antes de utilizar. 1,5 mM) Também disponível comercialmente (por exemplo, BSA (fracção V) (10 %) 0,25 μl 0,1 % Invitrogen ou equivalente). Mistura d-NTP (20 mM) 0,125 μl 0,1 mM APÊNDICE N.º 7 Iniciador Rs-1-F (10 μM) 1 μl 0,4 μM Iniciador Rs-3-R (10 μM) 1 μl 0,4 μM Reagentes validados para o teste FISH * Taq polimerase (5U/μl) ( ) 0,2 μl 1U 1— Sondas: Volume da amostra 5,0 μl Sonda específica para R. solanacearum OLI-1-CY3: Volume total: 25,0 μl 5’-GGC AGG TAG CAA GCT ACC CCC-3’; (*) O método foi validado utilizando Taq polimerase da Perkin Elmer Sonda para eubactérias (não específica) EUB-338- (AmpliTaq) e Gibco BRL. FITC: 5’-GCT GCC TCC CGT AGG AGT-3’. 4126 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 2 — Solução fixadora: 5 — Tampão fosfato 0,1 M, pH 7,0: Nota. — Atenção! O fixador contém paraformaldeí- Na2HPO4 — 8,52 g do, um produto tóxico. Utilizar luvas e não inalar. É KH2PO4 — 5,44 g aconselhável trabalhar em «hotte». Água destilada — 1,00 l i) Aquecer 9 ml de água de grau molecular [por Dissolver os ingredientes, verificar o pH e esterili- exemplo água ultra pura (UPW)] a cerca de 60° C e zar em autoclave a 121 ºC durante 15 minutos. adicionar 0,4 g de paraformaldeído. O paraformaldeí- do dissolve-se após a adição de 5 gotas de NaOH 1N APÊNDICE N.º 8 e a agitação com um agitador magnético; Condições de cultivo de beringela e tomateiro ii) Ajustar o pH a 7,0 mediante adição de 1 ml de tampão fosfato 0,1 M (PB, pH 7,0) e 5 gotas de HCl Semear tomateiros (Lycopersicon esculentum) ou 1N. Verificar o pH com papel indicador e ajustar, se beringelas (Solanum melongena) em tabuleiros com necessário, com HCl ou NaOH; substrato pasteurizado. O transplante das plântulas faz- se quando os cotilédones estão completamente expan- Nota. — Atenção! Não utilizar um medidor de PH didos (10 a 14 dias), para substrato de cultura pasteu- em soluções contendo paraformaldeído. rizado. iii) Filtrar a solução através de um filtro de mem- As beringelas ou os tomateiros devem ser cultiva- brana de 0,22 μm e manter ao abrigo de poeiras a 4 ºC dos em estufa nas seguintes condições ambientais an- até à sua utilização. tes da inoculação: 3 — «Hybmix» 3x : Fotoperíodo 14 horas ou duração do dia natural se esta for superior NaCl — 2,7 M Temperatura Diurna: 21 a 24 °C Tris-HCl — 60 mM (pH 7,4) Nocturna: 14 a 18 °C EDTA (esterilizado por filtração e autoclavado) — Variedade de tomateiro «Moneymaker» 15 mM susceptível Diluir até 1x, conforme necessário. Variedade de beringela «Black Beauty» susceptível 4 — Solução de hibridação: «Hybmix» 1x Fornecedores: Dodecilsulfato de sódio (SDS) — 0,01 % ver sítio web http://forum.europa.eu.int/Public/irc/ Formamida — 30 % sanco/Home/main. Sonda EUB 338 — 5 ng/μl Sonda OLI-1 ou OLI-2 — 5 ng/μl Referências bibliográficas Preparar quantidades de solução de hibridação de 1 — Amann, R.I., L. Krumholz and D.A. Stahl. acordo com os cálculos do quadro I. Para cada lâmina 1990. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole (contendo 2 amostras diferentes em duplicado) são cells for determinative, phylogenetic and environmen- necessários 90 μl de solução de hibridação. tal studies in microbiology. J. Bacteriol. 172: 762-770. 2 — Anon. 1998. Council Directive 98/57/EC of 20 Nota. — Atenção! A formamida é muito tóxica. July 1998 on the control of Ralstonia solanacearum Utilizar luvas e tomar as medidas de segurança neces- (Smith) Yabuuchi et al. Official Journal of the Euro- sárias! pean Communities L235, 1-39. QUADRO I 3 — Boudazin, G., A.C. Le Roux, K. Josi, P. La- Quantidades sugeridas para a preparação da solução barre and B. Jouan. 1999. Design of division specific de hibridação primers of Ralstonia solanacearum and application to the identification of European isolates. European Jour- Número de lâminas 1 4 6 8 10 nal of Plant Pathology 105; 373-380. 4 — Caruso, P., Gorris, M.T., Cambra, M., Palomo, UPW esterilizada 23,1 92,4 138,6 184,8 231,0 J.L., Collar, J and Lopez, M.M. 2002. Enrichment «Hybmix» 3x 30,0 120,0 180,0 240,0 300,0 Double-Antibody Sandwich Indirect Enzyme-Linked SDS 1 % 0,9 3,6 5,4 7,2 9,0 Immunosorbent Assay That Uses a Specific Monoclo- Formamida 27,0 108,0 162,0 216,0 270,0 nal Antibody for sensitive Detection of Ralstonia so- Sonda EUB 338 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 lanacearum in Asymptomatic Potato Tubers. Applied (100 ng/ȝl) and Environmental Microbiology, 68, 3634-3638. Sonda OLI-1 ou OLI-2 4,5 18,0 27,0 36,0 45,0 5 — Cook, D., Barlow, E. and Sequeira, L. 1989. (100 ng/ȝl) Genetic diversity of Pseudomonas solanacearum: de- Volume total (ȝl) 90,0 360,0 540,0 720,0 900,0 tection of restriction fragment length polymorphisms with DNA probes that specify virulence and the hyper- Nota: Armazenar todas as soluções contendo sondas fotossensíveis no escuro a uma temperatura de –20 ºC. sensitive response. Molecular Plant-Microbe Interac- Proteger da exposição directa à luz solar ou eléctrica durante a utilização. tions 1:113-121. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4127 6 — Elphinstone, J.G., Hennessy, J., Wilson, J.K. PCR primers for identifying Burkholderia solanacea- and Stead, D.E. 1996. Sensitivity of detection of Rals- rum (formerly Pseudomonas solanacearum). As Pac. tonia solanacearum in potato tuber extracts. EPPO J. Mol. Biol. Biotechnol. 5; 19-33. Bulletin 26; 663-678. 20 — Pastrik, K.H. and Maiss, E. 2000. Detection 7 — Englebrecht, M.C. (1994) Modification of a of R. solanacearum in potato tubers by polymerase semi-selective medium for the isolation and quantifi- chain reaction. J. Phytopathology 148; 619-626. cation of Pseudomonas solanacearum. In: A.C. 21 — Pastrik, K.H., Elphinstone, J.G. and Pukall, R. Hayward (ed.) Bacterial Wilt Newsletter 10, 3-5. Aus- 2002. Sequence analysis and detection of Ralstonia tralian Centre for International Agricultural Research, solanacearum by multiplex PCR amplification of 16S- Canberra, Australia. 23S ribosomal intergenic spacer region with internal 8 — Hayward, A.C. 1964. Characteristics of Pseu- positive control. European Journal of Plant Pathology domonas solanacearum. Journal of Applied Bacterio- 108, 831-842. logy 27; 265-277. 22 — Robinson-Smith, A., Jones, P., Elphinstone, 9 — Hayward, A.C., El-Nashaar, H.M., Nydegger, J.G. and Forde, S.M.D. (1995) Production of antibo- U. and De Lindo, L. 1990. Variation in nitrate meta- dies to Pseudomonas solanacearum, the causative bolism in biovars of Pseudomonas solanacearum. Jour- agent of bacterial wilt. Food and Agricultural Immu- nal of Applied Bacteriology 69; 269-280. nology 7, 67-79. 10 — Ito, S., Y. Ushijima, T. Fujii, S. Tanaka, M. 23 — Schaad, W. 2001. Laboratory guide for identi- Kameya-Iwaki, S. Yoshiwara and F. Kishi. 1998. De- fication of plant pathogenic bacteria. Schaad [Hrsg.]. — tection of viable cells of Ralstonia solanacearum in soil using a semi-selective medium and a PCR techni- 3. ed.; St. Paul, Minnesota: 373 pp. que. J. Phytopathology 146; 379-384. 24 — Seal, S.E., L.A. Jackson, J.P.W. Young, and 11 — Janse, J.D. (1988) A detection method for M.J. Daniels. 1993. Detection of Pseudomonas sola- Pseudomonas solanacearum in symptomless potato nacearum, Pseudomonas syzygii, Pseudomonas picket- tubers and some data on its sensitivity and specificity. tii and Blood Disease Bacterium by partial 16S rRNA Bulletin OEPP/EPPO Bulletin 18, 343-351. sequencing: construction of oligonucleotide primers for 12 — Janse, J.D. 1991. Infra- and intra-specific clas- sensitive detection by polymerase chain reaction. J. sification of Pseudomonas solanacaerum strains using Gen. Microbiol. 139: 1587-1594. whole cell fatty-acid analysis. Systematic and Applied 25 — Smith, J.J., Offord, L.C., Holderness, M. and Microbiology 14; 335-345. Saddler, G.S. 1995. Genetic diversity of Burkholderia 13 — Kelman, A. 1954. The relationship of patho- solanacearum (synonym Pseudomonas solanacearum) genicity of Pseudomonas solanacearum to colony race 3 in Kenya. Applied and Environmental Microbi- appearance on a tetrazolium medium. Phytopathology ology 61; 4262-4268. 44; 693-695. 26 — Stead, D.E. 1992. Grouping of plant patho- 14 — Klement Z.; Rudolph, K and D.C. Sands, genic and some other Pseudomonas spp. using cellu- 1990. Methods in Phytobacteriology. Akadémiai Kia- lar fatty-acid profiles. International Journal of Syste- dó, Budapest, 568 pp. matic Bacteriology 42; 281-295. 15 — Lelliott, R.A. and Stead, D.E. 1987. Methods 27 — Taghavi, M., Hayward, A.C., Sly, L.I., Fegan, for the diagnosis of bacterial diseases of plants. Bla- M. 1996. Analysiss of the phylogenetic relationships ckwell scientific Publications Ltd., Oxford. 216 pp. of strains of Burkholderia solanacearum, Pseudomo- 16 — Lopez, M.M., Gorris, M.T., Llop, P., Cube- nas syzygii, and the blood disease bacterium of bana- ro, J., Vicedo, B., Cambra, M., 1997. Selective enri- na based on 16S rRNA gene sequences. International chment improves selective isolation, serological and Journal of Systematic Bacteriology 46; 10-15. molecular detection of plant pathogenic bacteria. In: 28 — Van Der Wolf, J.M., Bonants, P.J.M., Smith, H.W. Dehne et al., (eds). Klewer Academic Publishers. J.J., Hagenaar, M., Nijhuis, E., Van Beckhoven, J.R.C., pp. 117-121. Saddler, G.S., Trigalet, A., Feuillade, R. 1998. Gene- 17 — Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. tic diversity of Ralstonia solanacearum Race 3 in and De Bruijn, F.J., 1994. Specific genomic finger- Western Europe as determined by AFLP, RC-PFGE prints of phytopathogenic Xanthomonas and Pseudo- and rep-PCR. In: Prior, P., Allen, C. and Elphinstone, monas pathovars and strains generated with repetitive J. (eds.) Bacterial wilt disease: Molecular and Ecolo- sequences and PCR. Applied and Environmental Mi- gical Aspects. Springer (Berlin) pp. 44-49. crobiology, 60, 2286-2295. 18 — Louws, F.J., Fulbright, D.W., Stephens, C.T. 29 — Weller, S.A., Elphinstone, J.G., Smith, N., and De Bruijn, F.J. 1995. Differentiation of genomic Stead, D.E. and Boonham, N. 1999. Detection of Rals- structure by rep-PCR fingerprinting to rapidly classify tonia solanacearum strains using an automated and Xanthomonas campestris pv. vesicatoria. Phytopatho- quantitative flourogenic 5’ nuclease TaqMan assay. Ap- logy 85; 528-536. plied and Environmental Microbiology 66; 2853-2858. 19 — Opina, N., F. Tavner, G. Holloway, J.-F 30 — Wullings, B.A., A.R. van Beuningen, J.D. Jan- Wang, T.-H Li, R. Maghirang, M. Fegan, A.C. se and A.D.L. Akkermans. 1998. Detection of R. so- Hayward, V. Krishnapillai, W.F. Hong, B.W. Hollo- lanacearum, which causes brown rot of potato, by flu- way, J.N. Timmis. 1997. A novel method for develo- orescent in situ hybridization with 23s rRNA-targeted pment of species and strain-specific DNA probes and probes. Appl. Environ. Microbiol. 64: 4546-4554. 4128 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 ANEXO III 1.1.6 — Em que se utilizem, para irrigação ou as- Ocorrência suspeita e confirmação da presença persão, águas superficiais provenientes de qualquer do organismo prejudicial ponto de que água de que se suspeite ou esteja con- firmada a contaminação pelo organismo prejudicial; 1 — Sempre que, em caso de ocorrência suspeita, 1.1.7 — Em que se utilizem, para irrigação ou as- para os materiais vegetais da lista e para todos os persão, águas superficiais provenientes de um ponto de outros casos, surja um resultado positivo no ou nos água partilhado com locais de produção de que se testes de rastreio efectuados em conformidade com os suspeite ou esteja confirmada a contaminação pelo métodos pertinentes constantes do anexo II, e se aguar- organismo prejudicial; de a confirmação ou refutação através da conclusão dos 1.1.8 — Que estejam ou tenham sido inundados por referidos métodos, deve proceder-se à retenção e con- águas superficiais de que se suspeite ou esteja confir- servação adequada, até à conclusão dos referidos mé- mada a contaminação pelo organismo prejudicial; e todos, de: 1.2 — Águas superficiais utilizadas para irrigação ou 1.1 — Todos os tubérculos e, sempre que possível, aspersão do ou dos campos ou locais de produção que todas as plantas sujeitas a amostragem; esteja confirmada a contaminação pelo organismo pre- 1.2 — Qualquer extracto restante e outro material judicial, ou que tenham inundado os mesmos. preparado para o(s) teste(s) de rastreio, por exemplo, lâminas de imunofluorescência; e ANEXO V 1.3 — Toda a documentação relevante. Determinação da extensão da contaminação provável e da possível dispersão do organismo prejudicial Nota. — A retenção dos tubérculos permite a reali- zação, sempre que necessária, do teste de variedade. 1 — Os elementos a considerar na determinação da extensão da contaminação provável nos termos da su- 2 — Em caso de confirmação da presença do orga- balínea iii) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d) nismo prejudicial, deve-se proceder à retenção e con- do n.º 1 do artigo 6.°, devem incluir: servação adequada, durante pelo menos um mês após 1.1 — Os materiais vegetais cultivados num local de a comunicação referida no n.º 2 do artigo 6.º: produção que tenha sido declarado contaminado ao 2.1 — Do material referido no n.º 1; abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do arti- 2.2 — De uma amostra de material infectado de go 6.°; tomateiro ou de beringela inoculada com o extracto do 1.2 — Os locais de produção com alguma relação tubérculo ou da planta, se for caso disso; e de produção com os materiais vegetais declarados con- 2.3 — De uma cultura isolada do organismo preju- taminados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do dicial. n.º 1 do artigo 6.°, incluindo os que partilham equipa- mentos e instalações de produção, directamente ou ANEXO IV através de um contratante comum; Elementos da investigação para a determinação 1.3 — Os materiais vegetais produzidos nos locais da extensão e da fonte primária da contaminação de produção referidos no número anterior, ou que te- 1 — Os elementos da investigação referida na su- nham estado presentes nesses locais durante o perío- balínea i) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, devem do em que os materiais vegetais declarados contami- incluir, sempre que relevante: nados ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 1.1 — Locais de produção que: do artigo 6.° se encontravam no local de produção 1.1.1 — Em que se cultive ou tenha cultivado batata referido no n.º 1.1; que tenha uma relação clonal com batata que se verifi- 1.4 — Instalações nas quais se manuseiem os mate- riais vegetais provenientes dos locais de produção re- cou estar contaminada pelo organismo prejudicial; feridos nos números anteriores, 1.1.2 — Em que se cultive ou tenha cultivado to- 1.5 — Quaisquer máquinas, veículos, recipientes, mate da mesma origem que o tomate que se verificou armazéns ou respectivas partes e quaisquer outros estar contaminado pelo organismo prejudicial; objectos, incluindo material de embalagem, que pos- 1.1.3 — Em que se cultive ou se tenha cultivado sam ter estado em contacto com os materiais vegetais batata ou tomate que tenham sido colocados sob con- declarados contaminados ao abrigo da subalínea ii) da trolo oficial por se suspeitar da ocorrência do organis- alínea b) do n.º 1 do artigo 6.°; mo prejudicial; 1.6 — Quaisquer materiais vegetais que tenham es- 1.1.4 — Em que se cultive ou tenha cultivado bata- tado armazenados em, ou em contacto com, qualquer ta que tenha uma relação clonal com batata cultivada das estruturas ou objectos referidos no número anteri- em locais de produção que se verificou estarem con- or, antes da limpeza e desinfecção dessas estruturas e taminados pelo organismo prejudicial; objectos; 1.1.5 — Em que se cultive batata ou tomate e que 1.7 — Em resultado das investigações e testes refe- estejam localizados na vizinhança de locais de produ- ridos na subalínea i) da alínea b) do nn.º 1 do arti- ção contaminados pelo organismo prejudicial, incluin- go 6.°, no caso da batata, os tubérculos ou plantas que do os locais de produção que partilhem entre si equi- tenham uma relação clonal colateral ou parental e, no pamentos e instalações de produção, directamente ou caso do tomate, as plantas que tenham a mesma ori- através de um contratante comum; gem que os materiais vegetais declarados contamina- Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4129 dos ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do 3.1.2 — No caso das plantas de tomateiro, o nome da artigo 6.° e em relação aos quais, embora os testes se variedade do lote e, sempre que aplicável, a categoria. tenham revelado negativos no que diz respeito ao or- 3.2 — Sem prejuízo da exigência de comunicação ganismo prejudicial, a contaminação se afigure prová- dos casos de ocorrência suspeita prevista no n.º 3 do vel através de uma ligação clonal, sendo que o teste artigo 5.º, após uma ocorrência confirmada e sempre de variedade pode ser efectuado no sentido de verifi- que exista um risco de contaminação dos materiais car a identidade dos tubérculos ou plantas contamina- vegetais provenientes ou com destino a outros Esta- dos que tenham uma relação clonal; dos membros deve ser comunicada de imediato à Co- 1.8 — Locais de produção dos materiais vegetais missão Europeia e aos organismos responsáveis dos referidos no número anterior; Estados membros em questão, a seguinte informação: 1.9 — Locais de produção dos materiais vegetais que 3.2.1 — O nome da variedade do lote de batata ou tenham usado, para irrigação ou aspersão, águas de- de tomate; claradas contaminadas ao abrigo da subalínea ii) da 3.2.2 — O nome e endereço do expedidor e do des- alínea d) do n.º 1 do artigo 6.°; tinatário; 1.10 — Materiais vegetais produzidos em campos 3.2.3 — A data da entrega do lote de batata ou de inundados por águas superficiais de que esteja confir- tomate; mada a contaminação. 3.2.4 — A dimensão do lote de batata ou de tomate 2 — Os elementos a considerar para determinar a entregue; possível dispersão ao abrigo da subalínea iv) da alí- 3.2.5 — Uma cópia do passaporte fitossanitário ou, nea b) e da subalínea iii) da alínea d) do n.º 1 do ar- pelo menos, o número do passaporte fitossanitário, tigo 6.°, devem incluir: sempre que adequado, ou se for o caso, o número do 2.1 — Nos casos abrangidos pela subalínea iv) da registo do produtor ou comerciante e uma cópia da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.°: nota de entrega. 2.1.1 — A proximidade de outros locais de produ- 4 — A comunicação adicional a que se refere o n.º 3 ção que cultivem materiais vegetais; do artigo 6.° contém os seguintes dados: 2.1.2 — A produção ou utilização comuns de lotes 4.1 — Para cada caso e após a conclusão de todas de batata-semente; as investigações: 2.1.3 — Os locais de produção que utilizam águas 4.1.1 — A data de confirmação da contaminação; superficiais para irrigação ou aspersão dos materiais 4.1.2 — Uma descrição sucinta da investigação efec- vegetais, nos casos em que haja ou tenha havido risco tuada para identificar a fonte e a possível dispersão de escorrência ou de inundação por essas águas a partir da contaminação, incluindo o nível de amostragem de locais de produção declarados contaminados ao efectuado; abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do arti- 4.1.3 — Informação sobre as fontes de contamina- go 6.°, ção identificadas ou presumidas; 2.2 — Nos casos em que as águas superficiais te- 4.1.4 — Pormenores sobre a extensão da contami- nham sido declaradas contaminadas ao abrigo da su- nação declarada, incluindo o número de locais de pro- balínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.°: dução e, no caso da batata, o número de lotes, com a 2.2.1 — Os locais de produção em que sejam pro- indicação da variedade e, caso se trate de batata-se- duzidos materiais vegetais adjacentes a, ou que este- mente, da categoria; jam em perigo de ser inundados por águas superfici- 4.1.5 — Pormenores relativos à demarcação da zona, ais declaradas contaminadas; incluindo o número de locais de produção, não decla- 2.2.2 — Qualquer bacia de irrigação distinta que rados como contaminados mas incluídos na zona; esteja associada às águas superficiais declaradas con- 4.1.6 — Pormenores relativos às águas declaradas, taminadas; incluindo o nome e a localização da massa de água e a 2.2.3 — Massas de água ligadas às águas superfici- extensão das águas declaradas proibidas para irrigação; ais declaradas contaminadas tendo em conta: 4.1.7 — Para qualquer remessa ou lote de plantas de a) A direcção e o caudal das águas declaradas con- tomateiro declarado contaminado, o número de passa- taminadas; porte fitossanitário e os certificados fitossanitários ou b) A presença de plantas solanáceas silvestres hos- certificado fitossanitário de reexportação, em confor- pedeiras. midade, respectivamente com o disposto no n.º 2.2 da secção I da parte A e na secção I da parte B do anexo V 3 — A comunicação a que se refere o n.º 2 do arti- do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro; go 6.° contém os seguintes dados: 4.1.8 — Quaisquer outras informações relacionadas 3.1 — Imediatamente após a presença do organismo com o ou os surtos confirmados que a Comissão Eu- prejudicial ter sido confirmada por testes laboratoriais, ropeia venha a solicitar. com recurso aos métodos estabelecidos no anexo II, pelo menos: ANEXO VI 3.1.1 — No caso da batata: Aplicação de medidas de protecção fitossanitária sob controlo oficial a) O nome da variedade do lote; b) O tipo (consumo, semente, etc.) e, sempre que 1 — As medidas sob controlo oficial a que se refe- aplicável, a categoria da batata-semente. re a que se refere o n.º 1 do artigo 7.°, consistem: 4130 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 1.1 — Na utilização para a alimentação animal após 2.2 — Quanto a outras partes das plantas, incluindo tratamento térmico que garanta a impossibilidade de resíduos de caules e folhas: sobrevivência do organismo prejudicial; ou 2.2.1 — Para destruição; ou 1.2 — Na eliminação num local de eliminação de 2.2.2 — Para qualquer outra utilização ou forma de resíduos destinado especificamente a esse efeito e ofi- eliminação, desde que seja comprovado que não exis- cialmente aprovado em que não existam riscos identi- te risco reconhecido de dispersão do organismo preju- ficáveis de fuga do organismo prejudicial para o meio dicial, e sob reserva de aprovação pelos serviços de ambiente, por exemplo, através de escorrência para inspecção fitossanitária da DRAP competente. terras agrícolas, ou do contacto com pontos de água 3 — Os métodos adequados para descontaminação que possam ser utilizados para irrigação de terras agrí- dos objectos referidos no n.° 3 do artigo 7.° são a lim- colas; ou peza e, quando necessário, desinfecção, de forma a 1.3 — Na incineração; ou garantir que não existe qualquer risco reconhecido de 1.4 — Na transformação industrial através de entre- dispersão do organismo prejudicial, devendo a sua ga directa e imediata a uma unidade de transformação aplicação ter lugar sob supervisão dos serviços de ins- com instalações de eliminação de resíduos oficialmen- pecção fitossanitária da DRAP competente. te aprovadas, relativamente aos quais se tenha conclu- 4 — A série de medidas a aplicar pelos serviços de ído pela não existência de qualquer risco identificável inspecção fitossanitária da DRAP competente nas zo- de dispersão do organismo prejudicial, e dotadas de nas demarcadas, estabelecidas ao abrigo da sub- um sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos alínea iv) da alínea b) e da subalínea iii) da alínea d) veículos de transporte que saem da referida unidade; ou do n.º 1 do artigo 6.°, e a que se refere o n.º 4 do 1.5 — Noutras medidas, desde que se tenha conclu- artigo 7.°, inclui as seguintes acções: ído que não existe qualquer risco identificável de dis- 4.1 — Nos casos em que os locais de produção te- persão do organismo prejudicial, sendo essas medidas, nham sido declarados contaminados ao abrigo da sub- bem como a respectiva justificação, comunicadas à alínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.°: Comissão Europeia e aos restantes Estados membros. 4.1.1 — Nos campos ou unidades de produção de 1.6 — Em que quaisquer resíduos remanescentes culturas protegidas declarados contaminados ao abri- associados às opções indicadas nos números anterio- go da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.°, res, e que resultem das mesmas, são eliminados por é aplicada uma das seguintes opções: métodos oficialmente aprovados em conformidade com 4.1.1.1 — Durante, pelo menos, os quatro períodos o disposto no anexo VII. de cultura subsequentes à declaração de contaminação: 2 — A utilização ou eliminação adequada dos ma- teriais vegetais a que se refere o n.º 2 do artigo 7.º, a) São tomadas medidas para a eliminar as plantas sob controlo dos serviços de inspecção fitossanitária espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como da DRAP competente, e se for o caso, com a devida outras plantas hospedeiras do organismo prejudicial, comunicação aos serviços de inspecção das outras incluindo solanáceas infestantes; e DRAP envolvidas de forma a garantir esse controlo a b) Não podem ser plantados: todo o momento, bem como, se for caso disso, medi- i) Tubérculos, plantas nem sementes verdadeiras de ante aprovação pelo organismo oficial responsável do batateira; Estado membro a que batata se destine e no qual irá ii) Sementes nem plantas de tomateiro; ser embalada ou transformada, no que diz respeito às iii) Outras plantas hospedeiras; instalações de eliminação de resíduos a que se refe- iv) Plantas de espécies do género Brassica para as rem os n.os 1.1 e 1.2, é: quais exista um risco reconhecido de sobrevivência do 2.2 — Quanto aos tubérculos de batata: organismo prejudicial; 2.1.2 — Para utilização como batata consumo, em- v) Culturas para as quais exista um risco reconhe- balada para entrega e utilização directa, sem mudança cido de dispersão do organismo prejudicial. de embalagem, num local com instalações de elimina- ção de resíduos adequadas, sendo que as batatas des- c) Na primeira época de colheita de batata ou to- tinadas à plantação apenas podem ser manuseadas no mate subsequente ao período especificado na alínea mesmo local, se tal for feito separadamente ou após anterior, e sob condição de o campo ter sido conside- limpeza e desinfecção; ou rado livre de plantas espontâneas de batateira ou de 2.1.2 — Para utilização como batata consumo para tomateiro e de outras plantas hospedeiras, incluindo transformação industrial e destinada a entrega directa solanáceas infestantes, durante inspecções oficiais em, e imediata a uma unidade de transformação com ins- pelo menos, dois períodos de cultura consecutivos talações adequadas de eliminação de resíduos e um anteriores à plantação: sistema de limpeza e desinfecção, pelo menos, dos veículos de transporte que saem da referida unidade; ou i) No caso da batata, apenas será permitida a pro- 2.1.3 — Para qualquer outra utilização ou forma de dução de batata consumo; eliminação, desde que seja comprovado que não existe ii) No caso da batata e do tomate, os tubérculos qualquer risco reconhecido de dispersão do organismo colhidos ou as plantas de tomateiro, conforme adequa- prejudicial e sob reserva de aprovação pelos serviços do, devem ser testados em conformidade com o pro- de inspecção fitossanitária da DRA competente. cedimento referido no anexo II. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4131 d) Na época de colheita de batata ou de tomate 4.1.2.2 — No segundo ano de cultura subsequente seguinte à referida na alínea anterior, e após um ciclo ao da declaração de contaminação: de rotação adequado, que é de dois anos, no mínimo, a) No caso da batata, só são plantadas, para produ- se se pretender cultivar batata-semente, é efectuada ção de batata-semente ou batata consumo, batatas-se- uma prospecção oficial nos termos do artigo 3.°; mente certificadas ou oficialmente testadas para deter- minar a ausência do organismo prejudicial e cultivadas 4.1.2.2 — Durante os cinco anos de cultura subse- sob controlo oficial em locais de produção, à excep- quentes ao da declaração de contaminação: ção dos indicados no n.º 4.1; a) São tomadas medidas para eliminar as plantas b) No caso do tomate, só são plantadas, para pro- espontâneas de batateira ou de tomateiro, bem como dução de plantas ou de tomate, plantas de tomateiro outras plantas hospedeiras naturais do organismo pre- obtidas de sementes que cumpram as exigências do judicial, incluindo solanáceas infestantes; e Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou, no b) O campo é tratado e mantido, durante os primei- caso de propagação vegetativa, de plantas de tomatei- ros três anos, em pousio completo ou plantado com ro produzidas a partir dessas sementes e cultivadas sob cereais de acordo com o risco reconhecido, ou como controlo oficial em locais de produção, à excepção dos pastagem permanente, com frequentes cortes ou com indicados no n.º 4.1. pastorícia intensiva, ou plantado com gramíneas desti- nadas à produção de semente, a que se seguirão dois 4.1.2.3 — Pelo menos no terceiro ano de cultura anos em que serão plantadas plantas que não sejam subsequente ao da declaração de contaminação: hospedeiras do organismo prejudicial e para as quais a) No caso da batata, só são plantadas, para produ- não exista um risco reconhecido de sobrevivência ou ção de batata-semente ou batata consumo, batatas-se- dispersão do organismo prejudicial; mente certificadas ou produzidas, sob controlo oficial, c) Na primeira época de colheita de batata ou a partir de batatas-semente certificadas; tomate subsequente ao período especificado na alí- b) No caso do tomate, só podem ser plantadas, para nea anterior, e sob condição de o campo ter sido produção de plantas ou de tomate, plantas de tomatei- considerado livre de plantas espontâneas de bata- ro obtidas de sementes que cumpram as exigências do teira ou de tomateiro e de outras plantas hospedei- Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou plan- ras do organismo prejudicial, incluindo solanáceas tas de tomateiro produzidas sob controlo oficial a par- infestantes, durante inspecções oficiais em, pelo tir dessas plantas. menos, dois anos de cultura consecutivos anterio- res à plantação: 4.1.2.4 — Em cada um dos anos de cultivo referi- i) No caso da batata, será permitida a produção de dos nos números anteriores, são tomadas medidas para batata-semente ou batata consumo; eliminar as plantas espontâneas de batateira e outras ii) Os tubérculos colhidos ou as plantas de toma- plantas hospedeiras naturais do organismo prejudicial, teiro, conforme adequado, devem ser testados em caso estejam presentes, e proceder-se-á, em alturas conformidade com o procedimento referido no apropriadas, a uma inspecção oficial da cultura em anexo II. desenvolvimento e, em cada campo de cultivo de ba- tata, ao teste oficial das batatas colhidas, em confor- 4.1.2 — Em todos os restantes campos do local de midade com o procedimento estabelecido no anexo II. produção contaminado e sob condição de os serviços 4.1.3 — Imediatamente após a declaração de conta- de inspecção fitossanitária da DRAP competente ob- minação ao abrigo da subalínea ii) da alínea b) do n.º 1 terem a garantia de que foi eliminado o risco de apa- do artigo 6.º, e após o primeiro ano de cultura subse- recimento de plantas espontâneas de batateira e de quente: tomateiro e de outras plantas hospedeiras naturais do 4.1.3.1 — Todas as máquinas e instalações de arma- organismo prejudicial, incluindo solanáceas infestantes, zenamento do local de produção que estejam envolvi- quando apropriado: das na produção de batata ou tomate devem ser lim- 4.1.2.1 — No ano de cultura subsequente ao da pas e, quando necessário, desinfectadas através de declaração de contaminação: métodos apropriados conforme especificado no n.º 3; 4.1.3.2 — São estabelecidos, quando necessário, a) Não são plantados tubérculos, plantas ou semen- controlos oficiais dos programas de irrigação e asper- tes verdadeiras de batateira nem qualquer outra planta são, os quais podem conduzir à sua proibição, para que possa constituir um hospedeiro do organismo pre- evitar a dispersão do organismo prejudicial. judicial; ou 4.1.4 — Numa unidade de produção de culturas pro- b) No caso de tubérculos de batata, só podem ser tegidas declarada contaminada ao abrigo da sub- plantados tubérculos de batata-semente certificada, alínea ii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º, nos casos unicamente para produção de batata consumo; em que seja possível a total substituição do meio de c) No caso de plantas de tomateiro, só podem ser cultura: plantadas, unicamente para produção de tomate, plan- 4.1.4.1 — Não são plantados tubérculos nem plan- tas de tomateiro obtidas de sementes que cumpram as tas ou sementes verdadeiras de batateira, nem nenhu- exigências do Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Se- ma outra planta hospedeira do organismo prejudicial, tembro. incluindo plantas e sementes de tomateiro, a não ser 4132 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 quando a unidade de produção tiver sido sujeita, sob ro produzidas a partir dessas sementes cultivadas sob supervisão oficial, a medidas destinadas a eliminar o controlo oficial; organismo prejudicial e a remover todo o material e) Realizar uma prospecção oficial nos termos do vegetal hospedeiro, incluindo, no mínimo, a remoção artigo 3.º completa do meio de cultura e a limpeza e, quando necessário, desinfecção da unidade e de todo o equi- 4.2.2.2 — Nos casos em que as águas superficiais pamento, e quando os serviços de inspecção fitossani- tenham sido declaradas contaminadas ao abrigo da tária da DRAP competente tiverem concedido a sua subalínea ii) da alínea d) do n.º 1 do artigo 6.º, ou aprovação para fins de produção de batata ou de to- incluídas entre os elementos que eventualmente pos- mate; e sam contribuir para a dispersão do organismo prejudi- 4.1.4.2 — Para a produção de batata, apenas são cial, nos termos do n.º 2 do anexo V: utilizadas batatas-semente certificadas ou mini-tubércu- los ou micro-plantas provenientes de origens testadas; a) Realizar nas alturas apropriadas, uma prospecção 4.1.4.3 — Para a produção de tomate, apenas são anual, incluindo uma amostragem das águas superfi- utilizadas sementes que cumpram as exigências do ciais e, quando necessário, de solanáceas hospedeiras Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou, no que se encontrem junto dos pontos de água e, para os caso de propagação vegetativa, plantas de tomateiro materiais vegetais e noutros casos, a realização de tes- obtidas a partir dessas sementes e cultivadas sob con- tes de acordo com os métodos pertinentes previstos no trolo oficial; anexo II; 4.1.4.4 — São estabelecidos, quando necessário, b) Estabelecer controlos oficiais dos programas de controlos oficiais dos programas de irrigação e asper- irrigação e aspersão, incluindo a proibição de utiliza- são, os quais podem conduzir à sua proibição, para ção das águas declaradas contaminadas para irrigação evitar a dispersão do organismo prejudicial. ou aspersão dos materiais vegetais e, quando necessá- 4.2 — Dentro da zona demarcada, sem prejuízo das rio, de outras plantas hospedeiras, para evitar a dis- medidas definidas no n.º 4.1, os serviços de inspecção persão do organismo prejudicial, sendo que essa proi- fitossanitária da DRAP competente, devem: bição pode ser objecto de uma revisão com base nos 4.2.1 — Imediatamente após a declaração de conta- resultados da citada prospecção anual e essas determi- minação, assegurar a limpeza e desinfecção, consoan- nações revogadas, sob condição dos serviços de ins- te for apropriado, de toda a maquinaria e armazéns das pecção fitossanitária da DRAP competente, obterem a referidas instalações que estejam envolvidos na produ- garantia de que as águas superficiais já não se encon- ção de batata ou de tomate, utilizando métodos ade- tram contaminadas, sendo que a utilização das águas quados, tal como disposto no n.º 3. sujeitas a proibição pode ser permitida, mediante con- 4.2.2 — Imediatamente, e pelo menos durante os três trolo oficial, para irrigação ou aspersão de plantas anos de cultura subsequentes à declaração de conta- hospedeiras, nos casos em que haja recurso a técnicas minação: oficialmente aprovadas para eliminação do organismo 4.2.2.1 — Nos casos em que a zona tenha sido de- prejudicial e prevenção da sua dispersão; marcada ao abrigo da subalínea iv) da alínea b) do n.º 1 c) Nos casos em que haja contaminação de descar- do artigo 6.º: gas de resíduos líquidos, estabelecer controlos oficiais da eliminação de descargas de resíduos sólidos ou lí- a) Garantir, através dos serviços de inspecção fitos- quidos provenientes de instalações de transformação sanitária da DRAP competente, o controlo das insta- industrial ou de embalagem que manuseiem materiais lações em que se cultivem, armazenem ou manuseiem vegetais. tubérculos de batata ou tomate, e também das instala- ções em que sejam utilizadas máquinas destinadas à 4.2.3 — Estabelecer, quando necessário, um progra- produção de batata ou tomate sob contrato; ma de substituição de todos os lotes de batata-semen- b) Exigir, para todas as culturas de batata da zona, te ao longo de um período de tempo adequado. que só sejam plantadas batatas-semente certificadas ou sementes cultivadas sob controlo oficial, e que sejam ANEXO VII analisadas após colheita as culturas de batata-semente Eliminação de resíduos associáveis ao organismo prejudicial efectuadas em locais de produção declarados como provavelmente contaminados nos termos da subalínea 1 — Os métodos de eliminação de resíduos oficial- iii) da alínea b) do n.º 1 do artigo 6.º; mente aprovados a que se refere o n.º 1 do anexo VI c) Exigir que os lotes de batata-semente e de batata devem obedecer às seguintes disposições, por forma a consumo colhidas na zona sejam manuseados separa- obviar quaisquer riscos identificáveis de dispersão do damente ou a intervenção de um sistema de limpeza e organismo prejudicial: quando necessário, desinfecção entre o manuseamento 1.1 — Os resíduos de batata e tomate (incluindo de lotes de batata-semente e batata consumo; cascas de batata e batatas e tomates rejeitados) e qual- d) Exigir, para todas as culturas de tomate da zona, quer outro resíduo sólido associado à batata e ao to- que só sejam plantadas plantas de tomateiro obtidas a mate (incluindo terra, pedras e outro detritos) são su- partir de sementes que cumpram as exigências do jeitos ao seguinte: Decreto-Lei n.º 154/2005, de 6 de Setembro, ou, no 1.1.2 — Eliminação, num local de eliminação de caso de propagação vegetativa, de plantas de tomatei- resíduos destinado especificamente a esse efeito e apro- Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4133 vado oficialmente em que não existam riscos identifi- ordenados, de modo a ter em conta os princípios de cáveis de fuga do organismo prejudicial para o meio sustentabilidade e de conservação das espécies; ambiente, por exemplo, através da escorrência para Considerando por fim que um menor número de datas terras agrícolas ou de contacto com pontos de água que de abertura e de fecho da caça às espécies contribui possam ser utilizados para irrigação de terras agríco- para uma melhor gestão e exploração adequada do patri- mónio cinegético e conduz a uma maior facilidade de las, sendo os resíduos directamente transportados para cumprimento das normas por parte dos caçadores: esses locais em condições de confinamento de forma Assim: a que não exista risco de perda de resíduos, ou Ao abrigo do disposto nos artigos 3.o e 91.o a 106.o 1.1.2 — Incineração; ou do citado diploma, manda o Governo, pelo Ministro 1.1.3 — Outras medidas, desde que se tenha conclu- da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas, ído que não existe qualquer risco identificável de dis- o seguinte: persão do organismo prejudicial, sendo essas medidas 1.o Na época venatória de 2007-2008 é permitida a comunicadas à Comissão Europeia e aos restantes caça às seguintes espécies cinegéticas: rola, patos (pato- Estados membros. -real, marreco, marrequinha, frisada, arrabio, pato-trom- 1.2 — Os resíduos líquidos, antes de serem elimi- beteiro, piadeira, zarro-negrinha e zarro-comum), galei- nados, que contenham sólidos em suspensão são su- rão-comum, galinha-d’água, pombos (bravo, torcaz e da jeitos a processos de filtração ou decantação para re- rocha), codorniz, tarambola-dourada, galinhola, narce- moção dos mesmos, os quais após serem removidos, jas (comum e galega), tordos (tordo-comum, tordo- -ruivo, tordo-zornal e tordeia), estorninho-malhado, são eliminados em conformidade com o referido no perdiz-vermelha, faisão, coelho-bravo, lebre, raposa, n.º 1.1. saca-rabos, javali, veado, gamo, corço e muflão. 1.2.1 — Os resíduos líquidos são, depois: 2.o Os processos de caça às espécies cinegéticas indi- a) Aquecidos a uma temperatura mínima de 60º C cadas no número anterior são os permitidos nos arti- atingida em todo o seu volume durante, pelo menos, gos 92.o a 106.o do Decreto-Lei n.o 202/2004, de 18 de 30 minutos antes de serem eliminados; ou Agosto, com a redacção conferida pelo Decreto-Lei n.o 201/2005, de 24 de Novembro, para cada espécie b) Eliminados de outro modo, sujeito a aprovação referida no n.o 1 e consoante se trate de terrenos orde- e controlo oficial, de forma a que não exista qualquer nados ou não. risco identificável de que os resíduos venham a entrar 3.o Os limites diários de abate para as espécies cine- em contacto com as terras agrícolas ou com pontos de géticas referidas no n.o 1, bem como os respectivos perío- água que possam ser utilizados para irrigação da ter- dos e outros condicionamentos venatórios, são os cons- ras agrícolas, devendo os respectivos pormenores ser tantes dos quadros anexos à presente portaria e da qual comunicados aos restantes Estados-membros e à Co- fazem parte integrante. missão Europeia. 4.o Exceptuam-se do disposto no número anterior, em terrenos cinegéticos ordenados, os limites de abate 2 — As opções descritas no presente anexo são fixados para as espécies sedentárias, que obedecem ao igualmente aplicáveis aos resíduos associados ao ma- previsto nos planos anuais de exploração no caso de nuseamento, à eliminação e à transformação de lotes zonas de caça municipais ou nos planos de ordenamento contaminados. e exploração cinegética, no caso das zonas de caça asso- ciativas e turísticas. Portaria n.o 751/2007 18 de Junho de 2007. — O Ministro da Agricultura, do Desenvolvimento Rural e das Pescas, Jaime de Jesus de 27 de Junho Lopes Silva. Considerando a necessidade de identificar para a ANEXO I época venatória de 2007-2008 as espécies cinegéticas que é permitido caçar, bem como fixar os respectivos Espécies migratórias limites diários de abate, períodos de caça, processos Terrenos ordenados e não ordenados e outros condicionamentos venatórios, de acordo com o disposto no n.o 2 do artigo 3.o e no artigo 91.o do Rola-comum, patos (pato-real, marreco, marrequi- Decreto-Lei n.o 202/2004, de 18 de Agosto, com a redac- nha, frisada, arrabio, pato-trombeteiro, piadeira, zarro- ção conferida pelo Decreto-Lei n.o 201/2005, de 24 de -negrinha e zarro-comum), galeirão-comum, gali- Novembro; nha-d’água, pombos (bravo, torcaz e da rocha), codorniz, Considerando a especificidade diferenciada da acti- tarambola-dourada, galinhola, narcejas (comum e vidade venatória relativa às espécies sedentárias e às galega), tordos (tordo-comum, tordo-ruivo, tordo-zornal migratórias, bem como aos terrenos ordenados e não e tordeia) e estorninho-malhado: Espécie Limite diário Período venatório Edital Rola-comum . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 De 15 de Agosto a 30 de Setembro de 2007 De 15 de Agosto a 30 de Setembro de 2007. Patos e galeirão . . . . . . . . . . . . . . . (*) 10 De 2 de Setembro de 2007 a 20 de Janeiro De 2 a 30 de Setembro de 2007 e de 1 a 20 de 2008. de Janeiro de 2008. Galinha-d’água . . . . . . . . . . . . . . . 5 4134 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 Espécie Limite diário Período venatório Edital Pombo-da-rocha . . . . . . . . . . . . . . 10 De 15 de Agosto a 30 de Dezembro de 2007 De 15 de Agosto a 30 de Setembro de 2007. Pombo-torcaz e pombo-bravo . . . (*) 50 De 15 de Agosto de 2007 a 17 de Fevereiro De 15 de Agosto a 30 de Setembro de 2007 de 2008. e de 1 de Janeiro a 17 de Fevereiro de 2008. Codorniz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 De 2 de Setembro a 25 de Novembro de 2007 De 2 a 30 de Setembro de 2007. Narcejas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (*) 5 De 28 de Outubro de 2007 a 17 de Fevereiro De 1 de Janeiro a 17 de Fevereiro de 2008. de 2008. Tarambola-dourada . . . . . . . . . . . 5 De 28 de Outubro de 2007 a 20 de Janeiro De 1 a 20 de Janeiro de 2008. de 2008. Tordos e estorninho-malhado . . . (*) 30 De 28 de Outubro de 2007 a 17 de Fevereiro De 1 de Janeiro a 17 de Fevereiro de 2008. de 2008. Galinhola . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 (*) Limite diário de abate para o conjunto das espécies. ANEXO II Espécies sedentárias Terrenos ordenados Perdiz-vermelha, faisão, coelho-bravo, lebre, raposa, saca-rabos, javali, veado, gamo, corço e muflão: Espécie Limite diário Período venatório Coelho-bravo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 1) De 2 de Setembro a 31 de Dezembro de 2007 (3). Lebre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 1) Faisão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 1) De 5 de Outubro a 31 de Dezembro de 2007. Perdiz-vermelha . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 1) Raposa e saca-rabos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 1) De 5 de Outubro de 2007 a 29 de Fevereiro de 2008. Javali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 1) ( 2) De 1 de Junho de 2007 a 31 de Maio de 2008. Veado, gamo, corço e muflão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1) (1) Os limites são os do plano anual de exploração ou de ordenamento e exploração cinegético. (2) A caça de salto ao javali só pode ser permitida nos meses de Janeiro e Fevereiro. (3) A caça à lebre a corricão tem início a 1 de Outubro e termina a 17 de Fevereiro. ANEXO III Espécies sedentárias Terrenos não ordenados Perdiz-vermelha, coelho-bravo, lebre, raposa, saca-rabos, javali, veado, gamo, corço e muflão: Espécie Limite diário Período venatório Edital Coelho-bravo . . . . . . . . . . . . . . . . . 5 De 5 de Outubro a 16 de Dezembro de 2007. Lebre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 Perdiz-vermelha . . . . . . . . . . . . . . 3 De 5 de Outubro a 30 de Dezembro de 2007. Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 4135 Espécie Limite diário Período venatório Edital Raposa e saca-rabos . . . . . . . . . . . ( 1) 3 De 5 de Outubro de 2007 a 24 de Fevereiro De 1 de Janeiro a 24 de Fevereiro de 2008. de 2008. Javali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ( 2) De 5 de Outubro de 2007 a 24 de Fevereiro de 2008. Veado, gamo, corço e muflão . . . ( 2) De 1 de Junho de 2007 a 31 de Maio de De 1 de Junho de 2007 a 31 de Maio de 2008. 2008. (1) Limite diário por espécie e não aplicável quando o processo seja de batida ou a corricão. (2) Os limites são os constantes em edital da DGRF. 4136 Diário da República, 1.a série — N.o 122 — 27 de Junho de 2007 I SÉRIE Preço deste número (IVA incluído 5%) DIÁRIO G 5,18 DA REPÚBLICA Depósito legal n.º 8814/85 ISSN 0870-9963 Diário da República Electrónico: Endereço Internet: http://dre.pt Correio electrónico: dre@incm.pt • Linha azul: 808 200 110 • Fax: 21 394 5750 Toda a correspondência sobre assinaturas deverá ser dirigida para a Imprensa Nacional-Casa da Moeda, S. A., Departamento Comercial, Sector de Publicações Oficiais, Rua de D. Francisco Manuel de Melo, 5, 1099-002 Lisboa